Una fosfatasa lipídica MTMR conservada suprime cada vez más la autofagia en las neuronas cerebrales durante el envejecimiento

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 21817 (2022) Citar este artículo

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El envejecimiento es impulsado por la acumulación progresiva y permanente de daño celular. La autofagia (autoalimentación celular) funciona como un importante mecanismo de limpieza celular para degradar dichos daños, y su capacidad disminuye con la edad. A pesar de su importancia fisiológica y médica, se desconoce en gran medida por qué la autofagia se vuelve incapaz de eliminar de manera efectiva los materiales celulares dañinos en muchas células a edades avanzadas. Aquí mostramos que los defectos asociados con la edad en la degradación autofágica ocurren tanto en las etapas tempranas como tardías del proceso. Además, en la mosca de la fruta Drosophila melanogaster, la tirosina fosfatasa derivada del huevo (EDTP) de la fosfatasa lipídica relacionada con la miotubularina (MTMR), conocida como represor de la autofagia, se acumula gradualmente en las neuronas cerebrales durante la vida adulta. El aumento relacionado con la edad en la actividad de EDTP está asociado con una creciente metilación de ADN N6-adenina en el locus EDTP. MTMR14, la contraparte humana de EDTP, también tiende a acumularse con la edad en las neuronas cerebrales. Por lo tanto, EDTP, y presumiblemente MTMR14, promueve el envejecimiento cerebral al suprimir cada vez más la autofagia durante la edad adulta. Proponemos que las fosfatasas EDTP y MTMR14 funcionan como factores proenvejecimiento endógenos que establecen la velocidad a la que las neuronas envejecen en gran medida independientemente de los factores ambientales, y que la autofagia está influenciada por los niveles de ADN N6-metiladenina en insectos.

La acumulación de daño celular es un sello característico de prácticamente todas las células que envejecen1,2,3,4,5,6,7. Dichos daños incluyen principalmente proteínas oxidadas, agregadas y mal plegadas (es decir, no funcionales), que interfieren con los procesos celulares y la homeostasis, lo que conduce a la senescencia y posterior pérdida de las células afectadas. Los niveles masivos de muerte celular pueden conducir al desarrollo de varias patologías degenerativas asociadas con la edad, particularmente enfermedades neurodegenerativas. Por lo tanto, la eliminación efectiva de los materiales citosólicos dañados es crucial para el funcionamiento a largo plazo y la supervivencia de las células, principalmente para aquellas que se han diferenciado terminalmente y han perdido su capacidad de proliferación, como las neuronas.

La autofagia actúa como un importante proceso catabólico de las células eucariotas mediante el cual se puede eliminar eficazmente el daño celular8,9,10,11,12. Durante la autofagia, partes del citoplasma se entregan a los lisosomas para su degradación por hidrolasas ácidas. Dependiendo del mecanismo por el cual la carga autofágica se entrega en el compartimento lisosomal, se pueden distinguir tres tipos principales de autofagia: microautofagia, autofagia mediada por chaperonas y macroautofagia. La macroautofagia (en lo sucesivo denominada autofagia) implica la formación de una vesícula unida a una membrana doble llamada autofagosoma para secuestrar los materiales citoplasmáticos destinados a la degradación. Luego, el autofagosoma se fusiona con un lisosoma para formar un autolisosoma, en el que finalmente tiene lugar la descomposición enzimática (Fig. 1, A). Los defectos en el proceso autofágico están implicados en el desarrollo de diversas patologías neurodegenerativas9,13,14. Esto plantea la posibilidad de que la autofagia funcione con menos eficacia en las neuronas a edades avanzadas en comparación con las etapas adultas tempranas. En el nematodo Caenorhabditis elegans y la mosca de la fruta Drosophila melanogaster, se encontró que la autofagia operaba a niveles significativamente más bajos en animales viejos que en adultos jóvenes15,16,17. Esta disminución de la capacidad autofágica relacionada con la edad se acompaña de una disminución de la expresión de un gen clave relacionado con la autofagia (Atg), Atg8/LC3B (proteínas asociadas a microtúbulos 1A/1B, cadena ligera 3B), que codifica una proteína similar a la ubiquitina necesaria para la formación de estructuras de membrana autofágicas18. A pesar de su importancia fisiológica y médica, todavía se desconoce en gran medida por qué la capacidad de autofagia disminuye con la edad en las neuronas. Los procesos estocásticos, incluidas las mutaciones de inactivación aleatorias en los genes Atg en el genoma de las neuronas individuales, ciertamente deberían contribuir a la descomposición6,7. También pueden estar involucrados factores regulatorios aún en gran parte inexplorados. Según un estudio reciente, Rubicon (dominio RUN y dominio rico en cisteína que contiene, proteína que interactúa con Beclin 1), que inhibe la autofagia al interactuar con un complejo proteico que contiene Beclin 1 (coil enrollado, proteína que interactúa con BCL2 similar a la miosina), Vps15/p150 (clasificación de proteína vacuolar 15), PI3K (la fosfatidilinositol-3 quinasa de clase III) y UVRAG (gen asociado a la resistencia a la radiación ultravioleta) regulan cada vez más a la baja el proceso durante el envejecimiento en gusanos, moscas y ratones19. Sin embargo, sigue sin resolverse por qué Rubicon se acumula progresivamente con la edad en varios tipos de células.

La capacidad de autofagia disminuye gradualmente con la edad en el cerebro de Drosophila. (A) El proceso macroautofágico de los mamíferos. Durante la autofagia, los componentes citoplásmicos no deseados (se indican las proteínas y las mitocondrias) son secuestrados en una vesícula de doble membrana llamada autofagosoma. El autofagosoma se forma por la elongación y fusión de una membrana fagófora. El esquema indica dónde ejercen sus efectos los marcadores autofágicos Atg5, clase III PI3K, Atg8/LC3B-II y SQSTM1/p62 durante el proceso. Atg5 y PI3K (este último está indicado por 2xFYVE-GFP) etiquetan las primeras etapas del proceso (formación de fagóforos), Atg8/LC3B-II designa tanto fagóforos como autofagosomas, mientras que p62 es una proteína adaptadora que sirve como sustrato para la descomposición autofágica. Atg8-I: forma soluble; Atg8-II: forma conjugada con membrana. La cisteína proteasa Atg4 desconjuga Atg8-II de la membrana del autofagosoma (es decir, interviene en la conversión de Atg8-II en Atg8-I) cuando se forma el autofagosoma. MTMR14 inhibe la formación de membranas autofágicas al antagonizar el complejo PI3K de clase III. Las barras indican interacciones reguladoras negativas, las flechas indican activaciones. (B) Niveles de Atg5- (primera fila), 2xFYVE-GFP- (segunda fila), eGFP-Atg8a (tercera fila) y estructuras positivas para Ref(2)P/p62 (cuarta fila) en el cerebro de adultos de Drosophila en diferentes edades. Atg5 y 2xFYVE-GFP marcan estructuras autofágicas tempranas, fagoforos y autofagosomas nacientes. En cada fila, se capturaron imágenes microscópicas de fluorescencia con el mismo tiempo de exposición. Para 2xFYVE-GFP, se usó un transgén etiquetado con GFP; de lo contrario, se usaron anticuerpos específicos. Las barras de escala corresponden a 25 µm. La tinción de Hoechst (azul) indica núcleos. (B′–B″″) Cuantificación de estructuras Atg5-, 2xFYVE-GFP-, eGFP-Atg8a- y Ref(2)P-positivas. (C) Análisis de transferencia Western que muestra los niveles relativos de Ref(2)P y Atg8a-I/II en extractos de cabeza completa diseccionados en diferentes etapas adultas. Atg8a-II marca fagoforos y autofagosomas. Se utilizó α-Tub84B como control interno. (C,C″) Cuantificación de las densidades relativas de Ref(2)P, así como los niveles relativos de Atg8-I y Atg8-II determinados por el análisis de transferencia Western (C). En los paneles (B′–B″″), (C′) y (C″), en el gráfico, las cajas representan el 50 % más típico de las muestras, la línea indica la mediana, los bigotes superior e inferior muestran el 25 restante– 25% de las muestras. Los círculos marcan valores atípicos. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001 en cada comparación con el día 1. Para estadísticas, consulte "Materiales y métodos".

La formación de estructuras de membrana autofágicas tempranas requiere ciertos derivados de fosfoinosítidos (PI) como el fosfatidilinositol 3-fosfato (PI3P), que se convierte de PI por la enzima PI3K de clase III (Fig. 1A)20. PI3K, también llamado Vps34 (clasificación de proteína de vacuola), es un miembro del complejo de nucleación de vesículas autofágicas. En condiciones normales, la fosfatasa lipídica relacionada con la miotubularina de mamíferos MTMR14 y su ortólogo de Drosophila EDTP (tirosina fosfatasa derivada del huevo) antagonizan PI3K/Vps34 para prevenir la hiperactivación dañina de la autofagia21,22,23. MTMR14 inhibe la autofagia basal mediante la conversión de PI3P en PI24. En antecedentes genéticos defectuosos para MTMR14 o EDTP, la cantidad de estructuras enriquecidas con PI3P se eleva en relación con el control22,25. Además de esta etapa inicial de autofagia, MTMR14 también regula una etapa posterior del proceso, en la fusión de autofagosoma con lisosoma (Fig. 1A)22. En este estudio mostramos que EDTP y MTMR14 se acumulan cada vez más con la edad en las neuronas cerebrales. Estas fosfatasas de lípidos MTMR conservadas contribuyen a la disminución de la autofagia en las neuronas dependiente de la edad, lo que promueve el envejecimiento cerebral.

Para comprender mejor cómo disminuye la autofagia con la edad, primero determinamos los niveles relativos de la actividad autofágica durante la vida adulta en Drosophila. Dos marcadores ampliamente utilizados para monitorear las primeras etapas de la autofagia, Atg5 y el dominio 2xFYVE (Fig. 1A) 26,27, mostraron niveles de acumulación gradualmente decrecientes en cerebros aislados de moscas adultas en diferentes etapas de la vida (Fig. 1B-B "). Debido a que Atg5 juega un papel en la extensión de la membrana de aislamiento en crecimiento llamada fagóforo, su nivel se correlaciona con la cantidad de la estructura28. El dominio FYVE se une a PI3P, por lo que su cantidad es proporcional a la actividad de PI3K/Vps3429. La aplicación de estos marcadores demostró claramente que la formación de fagóforos disminuye gradualmente en las neuronas cerebrales a medida que el organismo envejece. También evaluamos la cantidad de la forma autofágica conjugada con membrana de Atg8a, Atg8a-II30. La cantidad de estructuras autofágicas positivas para Atg8a marcadas por un informador31 eGFP-Atg8a expresado endógenamente se elevó progresivamente en el cerebro durante la vida adulta (Fig. 1B-B ‴). Debido a que eGFP es sensible a pH bajo, es inactivo en compartimentos ácidos, por lo que marca fagoforos y autofagosomas, pero no autolisosomas. Se obtuvieron resultados similares al probar los niveles de Atg8a-II en extractos de cerebro derivados de animales adultos en diferentes etapas, utilizando un análisis de transferencia Western (Fig. 1C, C″). A diferencia de Atg8a-II, el nivel de la forma soluble no conjugada de Atg8a (Atg8a-I) se mantuvo casi constante durante la edad adulta. Estos datos indican que, a pesar de la reducción de la formación de fagoforos, los autofagosomas se generaron a un ritmo cada vez mayor durante la vida adulta. Alternativamente, también se vio afectada una etapa posterior del proceso de degradación, lo que llevó a una acumulación neta de autofagosomas o autolisosomas no digestivos. Posiblemente la fusión autofagosoma-lisosoma, la acidificación lisosomal o la degradación del contenido autolisosomal es la etapa afectada.

Para distinguir entre las dos alternativas anteriores, evaluamos la cantidad de Ref(2)P, la contraparte de la mosca del p62/SQSTM1 humano (Sequestosoma 1) durante la vida adulta15. Debido a que p62/SQSTM1 sirve como sustrato para la degradación autofágica (la proteína une la carga con Atg8/LC3B unida a la membrana), su nivel es inversamente proporcional a la actividad autofágica32,33. Usando un anticuerpo específico de Ref(2)P, realizamos un análisis inmunohistoquímico en muestras de cerebro diseccionadas en diferentes etapas adultas y descubrimos que cuanto mayor era el animal, mayor era la cantidad de agregados de proteínas insolubles marcados por el anticuerpo (Fig. 1B, B""). Para fortalecer estos resultados, se aplicó un análisis de transferencia Western posterior a muestras de cabeza completa, utilizando el mismo anticuerpo específico para Ref(2)P. De acuerdo con los datos obtenidos por microscopía de fluorescencia, la cantidad de proteína Ref (2) P soluble se elevó gradualmente con la edad en los extractos de cabeza (Fig. 1C, C '). Juntos, estos resultados implican que durante el envejecimiento, la degradación autofágica se ve afectada en dos etapas del proceso. Primero, como lo revelan los niveles reducidos de Atg5 y PI3P, en la nucleación de vesículas cuando se forma y crece el fagóforo. En segundo lugar, como indica el aumento de la acumulación de Atg8a-II, después de la formación del autofagosoma cuando la estructura se fusiona con un lisosoma o el contenido autolisosomal se digiere enzimáticamente. Concluimos que la autofagia disminuye gradualmente con la edad en las neuronas cerebrales debido al efecto acumulativo de la supresión de la formación de autofagosomas y la función autolisosomal comprometida.

Se ha demostrado que MTMR14 influye en la autofagia en las etapas temprana (formación de fagóforos) y tardía (formación de autolisosomas) del proceso (Figs. 1A, 2A)22. Además, demostramos previamente que EDTP inhibe eficazmente la autofagia basal en el cuerpo graso de Drosophila23,25,34, y que MTMR14 se acumula abundantemente en la corteza cerebral humana35. Aquí, revelamos que los niveles de Atg8a-II y Ref(2)P aumentan en un fondo genético que sobreexpresa EDTP (Fig. 2B–B‴), pero son más bajos en un fondo mutante hipomórfico de EDTP (Fig. 2C–C‴). Además, la sobreexpresión de EDTP elevó significativamente la cantidad de estructuras ubiquitinadas (Fig. S1A-A '). Esto sugiere que, en condiciones normales, EDTP también inhibe la autofagia, además de la formación de autofagosomas, después de la lipidación de Atg8a.

La hiperactividad de EDTP inhibe, mientras que la deficiencia de EDTP aumenta, la actividad autofágica en el cerebro de Drosophila. (A) Función enzimática de EDTP de Drosophila y fosfatasas de lípidos MTMR14 de mamíferos. Las dos proteínas convierten PI3P en PI, lo que antagoniza la formación de membranas autofágicas. (B) El análisis de transferencia Western demuestra niveles elevados de EDTP y Ref(2)P en un fondo genético que sobreexpresa EDTP en comparación con el control. La forma conjugada con membrana autofágica de Atg8a (Atg8a-II) también aumenta en relación con Atg8a-I, que representa la forma soluble (no conjugada) de Atg8a. (B′–B‴) Cuantificación de los niveles relativos de EDTP, Ref(2)P, Atg8a-I y Atg8a-II, determinados por el análisis de Western blot (B). (C) El análisis de transferencia Western revela que los niveles relativos de EDTP, Ref(2)P y Atg8a-II/Atg8a-I disminuyen cada uno en un fondo genético defectuoso de EDTP (mutante hipomórfico) en relación con el control. (C′–C‴) Cuantificación de las densidades relativas de EDTP, Ref(2)P, Atg8a-I y Atg8a-II identificadas por el análisis de transferencia Western (C). En los paneles B y C, se extrajeron proteínas de la cabeza de moscas de la fruta hembra, se utilizó αTub84B como control interno y los animales se mantuvieron a 29 °C. En la gráfica, las cajas representan el 50 % más típico de las muestras, la línea indica la mediana, los bigotes superior e inferior muestran el 25–25 % restante de las muestras. Los círculos marcan valores atípicos. *P < 0,05; **P < 0,01; *** P < 0,001. Para estadísticas, consulte "Materiales y métodos".

Para comprender mejor las funciones neuronales de EDTP en el control de la autofagia, monitoreamos la co-localización de los reporteros mCherry-Atg8a y GFP-Lamp1 (específicos de la estructura lisosomal) en adultos de 7 y 21 días de edad mantenidos a 29 °C (Fig. .3A,A′ y Fig. S1B–B‴). El silenciamiento de EDTP (EDTP-RNAiV22) y la sobreexpresión (EDTPGSV6) aumentaron cada uno la colocalización de estos marcadores en animales de edad avanzada en relación con el control a la misma edad. En los genotipos control, la cantidad de estructuras marcadas por ambos marcadores fue significativamente mayor en los adultos mayores que en los jóvenes (Fig. 3A″–A‴ y Fig. S1B′). La regulación negativa de EDTP aumentó, mientras que la hiperactividad de EDTP disminuyó, el número de estructuras específicas de mCherry-Atg8a y GFP-Lamp1 (Fig. 3A ", A" y Fig. S1B '). La forma lipidada de Atg8a (Atg8a-II) es un sustrato de la degradación autofágica, y el reportero mCherry tolera el medio ácido de los autolisosomas36,37. Esto puede explicar por qué la deficiencia de EDTP eleva la cantidad de autolisosomas (estructuras positivas para mCherry-Atg8a) en un ensayo microscópico fluorescente, pero disminuye los niveles de Atg8a-II en un análisis de transferencia Western (Fig. 3A,A″ y Fig. 2C,C‴) . Por lo tanto, la sobreexpresión de EDTP podría inhibir la autofagia al generar menos estructuras autofágicas. Aunque estas estructuras son capaces de fusionarse con los lisosomas, el proceso de descomposición parece estar comprometido (como lo indican los niveles acumulados de Atg8a-II y el aumento de la colocalización de mCherry-Atg8a—GFP-Lamp1) (Figs. 2, 3). Se sabe que las proteínas MTMR desfosforilan los lípidos involucrados en la autofagia, como PI(3,5)P238, que se requiere para las etapas posteriores del proceso autofágico, incluida la acidificación de los lisosomas39 y la biogénesis lisosomal40. De acuerdo con nuestros resultados, EDTP puede bloquear simultáneamente la nucleación de vesículas (a través del complejo Vsp34 antagonizante) y la degradación lisosomal en las neuronas.

EDTP inhibe tanto la nucleación de vesículas autofágicas como la descomposición ácida en el cerebro de Drosophila. (A) Imágenes fluorescentes que muestran la colocalización de los reporteros GFP-Lamp1 (verde) y 3xmCherry-Atg8a (rojo) en neuronas del cerebro adulto de Drosophila. Las flechas amarillas indican estructuras etiquetadas por ambos marcadores. Los cuadrados blancos indican las áreas ampliadas. En los diagramas, se muestran datos estadísticos de muestras derivadas de animales en las etapas adultas de 7 y 21 días (A′–A‴). Los animales se mantuvieron a 29 °C. En la gráfica, los recuadros representan el 50 % más típico de las muestras, la línea indica la mediana, los bigotes superior e inferior muestran el 25–25 % restante de las muestras. Los círculos marcan valores atípicos. p<0,05; **P < 0,01; *** P < 0,001. Para estadísticas, consulte "Materiales y métodos".

Los datos relevantes de la literatura y los resultados anteriores nos llevaron a examinar los niveles relativos asociados con la etapa adulta (es decir, la dinámica de acumulación) de estas fosfatasas lipídicas MTMR conservadas en las neuronas cerebrales a lo largo de la vida adulta. Con este fin, analizamos la acumulación de EDTP en el cerebro a lo largo de la vida adulta. La expresión de EDTP se controló primero mediante un sistema de captura de genes fluorescentes, en el que se inserta un controlador troyano EDTP-Gal4 en la primera secuencia intrónica del gen EDTP, que controla la actividad del indicador UAS-myr-GFP (Fig. S2A). La actividad de EDTP exhibió un aumento gradual asociado con la edad en el órgano (Fig. 4A, A '). Se detectó una diferencia de casi el triple entre adultos jóvenes (día 10) y adultos mayores (día 60). Este cambio relacionado con la edad en la transcripción de EDTP fue particularmente evidente en estructuras cerebrales llamadas cuerpos en hongo, ganglios subesofágicos y lóbulos antenales (Fig. 3A y Fig. S1B), y no estuvo acompañado por un aumento en el número de neuronas que acumulan EDTP (Fig. S2C,C'). Durante el envejecimiento, los niveles de marcadores autofágicos cambiaron significativamente en el área del cuerpo del hongo; la cantidad de estructuras etiquetadas por 2xFYVE-GFP disminuyó mientras que los niveles de Ref (2) P aumentaron (Fig. S2D-E '). Un análisis de PCR cuantitativo en muestras de cabeza también mostró mayores cantidades de transcritos de EDTP en animales viejos en relación con los jóvenes (Fig. 4B). Estos resultados revelan que los niveles de transcripción de EDTP aumentan gradualmente en las neuronas cerebrales a medida que el animal envejece, lo que está en línea con un análisis previo de expresión génica de todo el genoma que identificó factores genéticos que aumentan o disminuyen durante el envejecimiento de Drosophila41.

EDTP se expresa cada vez más en las estructuras cerebrales durante la vida adulta de Drosophila. (A) Imágenes microscópicas de fluorescencia que muestran la expresión de un sistema de trampa del gen EDTP-troyano (actividad transcripcional de EDTP) en el cerebro disecado en diferentes etapas de la edad adulta (se indican los días). Las imágenes fueron capturadas con el mismo tiempo de exposición. La tinción de Hoechst (azul) indica núcleos. Los asteriscos rojos indican las médulas (brillo intenso) que se excluyeron del análisis. La barra de escala corresponde a 100 µm. Una línea punteada blanca delimita la sección del cerebro donde se realizó el análisis. (A ') Cuantificación de los niveles de expresión relativos de EDTP en el cerebro de moscas adultas a diferentes edades. (B) El análisis de qPCR en extractos de cerebro muestra que los niveles de transcripción de EDTP son más altos en adultos mayores (día 50 y día 60) que en adultos jóvenes (día 10). (C) El análisis de transferencia Western revela que el EDTP tiende a acumularse con la edad en los extractos de cabeza de Drosophila. Se utilizó αTub84B como control interno. (C ') Cuantificación de los niveles relativos de EDTP en extractos de cabeza en diferentes etapas adultas, determinado por el análisis de transferencia Western (C). Los animales se mantuvieron a 25 °C. En los paneles (A′)), (B) y (C′)), las cajas representan el 50% más típico de las muestras, la línea indica la mediana, los bigotes superior e inferior muestran el 25%-25% restante de las muestras . Los círculos marcan valores atípicos. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 en cada comparación con el día 1. Para obtener estadísticas, consulte "Materiales y métodos" y la Tabla S1. (D) La metilación de N6-adenina en el locus EDTP aumenta gradualmente con la edad en Drosophila. Niveles relativos de N6-metiladenina (6 mA) en el locus EDTP en diferentes etapas adultas. (D ') Cuantificación de niveles relativos de 6 mA en el sitio EDTP. Los animales se mantuvieron a 29 °C. En paneles (D′), *P < 0,05, **P < 0,01 en cada comparación con el día 7.

Usando un anticuerpo específico de EDTP, luego probamos la cantidad de proteína en extractos de cabeza completa. El anticuerpo fue capaz de marcar EDTP en el tipo salvaje, pero falló en gran medida en marcar una banda positiva para EDTP en el fondo mutante EDTPMI08496 (Fig. 2C-C‴). Un análisis de transferencia Western realizado descubrió que el EDTP tiende a acumularse cada vez más en la cabeza durante la vida adulta (Fig. 4C-C '). Por lo tanto, la actividad de EDTP aumenta progresivamente con la edad en el cerebro de Drosophila.

Para comprender por qué la expresión de EDTP aumenta con la edad en las neuronas cerebrales, examinamos los cambios en la modificación del ADN de N6-metiladenina (6 mA) en el locus EDTP durante la edad adulta (en general, la metilación de la adenina en la posición N6 promueve la transcripción en el locus afectado). Los niveles relativos de 6 mA en cualquier sitio genómico que contenga una secuencia GATC se pueden evaluar mediante un método basado en PCR, que implica una digestión enzimática DpnI sensible a la metilación del ADN genómico y una amplificación por PCR del sitio objetivo (Fig. 4D)42. Descubrimos que los niveles relativos de 6 mA en el sitio objetivo tienden a elevarse durante la vida adulta, una caída en los niveles de 6 mA solo se puede ver en las últimas etapas adultas (Fig. 4D-D '). Por lo tanto, los cambios relacionados con la edad en la expresión de EDTP y, como consecuencia, los cambios en la actividad autofágica pueden determinarse epigenéticamente en este organismo. Curiosamente, no se detectó un cambio similar en el caso del gen MTMR14 humano (datos no mostrados).

El movimiento defectuoso es un rasgo característico de las moscas envejecidas2,3,30,39,41. Debido a que la locomoción está coordinada por las neuronas, examinamos la capacidad de trepar en animales control frente a animales con EDTP defectuoso (es decir, autofagia hiperactiva) en diferentes etapas adultas. La regulación a la baja de EDTP se logró específicamente en neuronas dopaminérgicas mediante el uso de un controlador ple-Gal4 y dos construcciones de ARNi independientes que funcionan de manera efectiva, EDTP-RNAi (V22) y EDTP-RNAi (dsRNA) (ver "Materiales y métodos" y Figs. S3A –D′, S4A–A′). Ambos tratamientos aumentaron significativamente la capacidad de los animales para trepar por la pared de un vial de vidrio dentro de un período determinado (Fig. 5A, A 'y Fig. S3A'). En el caso de la construcción EDTP-RNAi (dsRNA), la mejora en el movimiento fue evidente incluso en etapas adultas posteriores (días 21 y 28, Fig. 5A, A '). A partir de estos resultados, concluimos que una disminución asociada con la edad en la actividad autofágica en neuronas específicas contribuye a un deterioro en la locomoción de las personas mayores, y este efecto puede retrasarse o atenuarse significativamente por la deficiencia de EDTP en las neuronas afectadas. Vale la pena señalar que en un experimento de control, la regulación negativa de EDTP aumentó notablemente, mientras que la hiperactividad de EDTP disminuyó, el número de estructuras autofágicas tempranas positivas para 2xFYVE-GFP en las células afectadas en las etapas de adultos jóvenes y adultos mayores (Fig. S5).

La regulación a la baja de EDTP en las neuronas puede mejorar la capacidad de escalada, reducir la ubiquitinación de proteínas en el cerebro y prolongar la vida útil. (A – A ') Usando dos construcciones de RNAi diferentes (ver también Fig. S2B, B'), EDTP se reguló a la baja en las neuronas dopaminérgicas. Las moscas se mantuvieron a 29 ° C, eGFP-RNAi (indica ON control de transgén UAS libre de objetivo) y EDTP-RNAi fueron impulsados ​​​​por un controlador ple-Gal4 expresado solo en neuronas dopaminérgicas. (B) Imágenes fluorescentes que muestran la acumulación de proteínas ubiquitinadas (agregados verdes) en el cerebro de moscas adultas en diferentes etapas (7 y 21 días). eGFP-RNAi se utilizó como control. La tinción de Hoechst (azul) indica núcleos. Los animales se mantuvieron a 29 °C. La barra de escala representa 40 µm. Las construcciones de ARNi fueron impulsadas por Appl-Gal4. (B ') Cuantificación de proteínas ubiquitinadas en dos etapas adultas diferentes. ( C ) Curvas de vida útil de Kaplan-Meyer de eGFP-RNAi (control de ARNi libre ON-target) versus EDTP-RNAi (dsRNA) (EDTP se reguló a la baja específicamente en neuronas dopaminérgicas) moscas. Los animales se mantuvieron a 25 °C. (C ') Datos de vida media de los animales que se muestran en el panel (C). ( D ) Curvas de vida útil de Kaplan-Meyer de eGFP-RNAi (control de ARNi libre ON-target), versus EDTP-RNAi (V22) y EDTP-RNAi (dsRNA) (EDTP se reguló a la baja solo en neuronas dopaminérgicas) animales. Las moscas se mantuvieron a 29 °C. (D ') Datos de vida media de los animales que se muestran en el panel (D). En los paneles (A), (A′), (B′), (C′) y (D′), las cajas representan el 50% más típico de las muestras, la línea indica la mediana, superior e inferior muestran los bigotes restantes 25%-25% de las muestras. Los círculos marcan valores atípicos. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, el análisis estadístico se realizó como se describe en Materiales y Métodos, para estadísticas ver Tabla S1.

En individuos de edad avanzada, las proteínas citoplasmáticas a menudo se ubiquitinan y esta marca molecular ayuda a los factores marcados a sufrir una degradación proteasómica o autofágica. Probamos la acumulación relacionada con la edad de proteínas ubiquitinadas en muestras cerebrales normales versus defectuosas con EDTP, mediante el uso de un controlador Appl-Gal4 panneuronal que está activo en prácticamente todas las neuronas. En las muestras de control, los niveles de estructuras marcadas con ubiquitina aumentaron significativamente con la edad, y este cambio fue suprimido de manera efectiva por la regulación negativa de EDTP (Fig. 5B, B '). La regulación a la baja de EDTP aumentó la cantidad de estructuras positivas para mCherry-Atg8a y GFP-Lamp1 (Fig. S3C-D ') y disminuyó significativamente los niveles de Ref (2) P en animales de 21 días mantenidos a 29 ° C, en comparación con control (Fig. S4C-D′). Por lo tanto, la mejora de la actividad autofágica mediante la inhibición de la función EDTP protege a las neuronas contra la acumulación de proteínas dañadas, que es una característica general en diversas patologías neurodegenerativas.

Debido a que la autofagia juega un papel central en la regulación del proceso de envejecimiento2,3,4,43 y el envejecimiento está controlado por sistemas de señalización que actúan en neuronas específicas16, también probamos el efecto de la regulación a la baja de EDTP específica de neuronas dopaminérgicas en la vida útil. EDTP se reguló específicamente a la baja durante la edad adulta mediante el uso del controlador ple-Gal4 y dos construcciones de ARNi independientes (Fig. S3A-B '; los animales se mantuvieron continuamente a 25 o 29 ° C). Observamos que los animales regulados a la baja para EDTP viven más que el control en ambas temperaturas probadas (Fig. 5C-D 'y Tabla S1). Estos resultados implican que el aumento de la actividad autofágica en las neuronas dopaminérgicas por la deficiencia de EDTP puede conducir a un efecto de longevidad. Por el contrario, la sobreexpresión de EDTP limita la vida útil e interfiere con la capacidad de escalar (Fig. S6A, A ').

Para abordar el problema de si el papel regulador de esta familia de fosfatasas de lípidos MTMR en el envejecimiento cerebral se conserva evolutivamente, a continuación monitoreamos los cambios dependientes de la edad en la actividad autofágica y la acumulación de MTMR14 en las neuronas del cerebro humano. Los niveles de p62/SQSTM1 se determinaron primero en muestras de cerebro humano post mortem aisladas a diferentes edades adultas (medianas y mayores). Descubrimos que la proteína se acumula en las neuronas cerebrales más abundantemente en personas de edad avanzada (70 a 80 años) que en personas más jóvenes (40 a 55 años) (Fig. 6A, A 'y Tabla S2). Por lo tanto, también puede ocurrir una disminución gradual en la capacidad de autofagia durante el envejecimiento cerebral en humanos. A la luz de este cambio negativo en la actividad autofágica, se puede explicar por qué las neuronas que no proliferan tienden a acumular daño celular de manera progresiva y se vuelven cada vez más sensibles a la muerte con el tiempo, lo que conduce al desarrollo de diversas afecciones neurodegenerativas a edades avanzadas.

SQSTM1/p62 y MTMR14 humanos se acumulan con la edad en las neuronas cerebrales. (A) Imágenes fluorescentes que muestran la acumulación de SQSTM1 (verde) en muestras de cerebro humano post mortem a la edad de 42 (izquierda) y 71 (derecha) años. Los cuadros blancos indican el área ampliada (a la derecha). Las imágenes fueron capturadas con el mismo tiempo de exposición. La tinción DAPI (azul) indica núcleos. Se usó un anticuerpo específico de SQSTM1 humano para la inmunohistoquímica. (A ') Cuantificación de los niveles de SQSTM1 en muestras de cerebro humano en diferentes etapas adultas. SQSTM1 se acumula más abundantemente en muestras envejecidas que en muestras jóvenes. (B) NeuN (verde)-MTMR14 (rojo) neuronas doblemente inmunoteñidas con DAPI (azul) en la capa 3 de la corteza temporal (BA 38) de un "joven" (arriba, SKO20, 27 años) y en un sujeto "viejo" (abajo, SKO18, 85 años), fotografiado con un microscopio de fluorescencia confocal. Las células inmunopositivas para NeuN son verdes, los puntos inmunopositivos para MTMR14 (pequeñas flechas blancas) son rojos, los núcleos son azules. Los cuadros de puntos blancos indican el área ampliada (a la derecha), las imágenes del panel derecho muestran el canal rojo (inmunoetiquetado MTMR14). Las puntas de flecha amarillas muestran lipofuscina autofluorescente (gotas moradas). La lipofuscina está presente en ambas muestras, pero es más abundante en el sujeto "viejo". Los puntos marcados con MTMR14 (puntas de flecha rojas) son visibles en los cuerpos celulares y las dendritas. Las barras de escala corresponden a 10 µm. (B') Diagrama de caja del área cubierta por inmunopositividad para MTMR14 en porcentaje de área celular por casos. La positividad para MTMR14 se midió en las células de la capa 3d de secciones corticales temporales inmunoteñidas con MTMR14. El gráfico muestra que el área de inmunopositividad para MTMR14 es mayor en los sujetos mayores que en los más jóvenes. Tenga en cuenta la alta variación individual entre las celdas en la mayoría de los casos. Los seis sujetos se dividieron en dos grupos como "jóvenes de mediana edad" que contenían sujetos de 27, 55 y 61 años frente a "ancianos" que contenían sujetos de 72, 77 y 85 años. Los dos grupos son significativamente diferentes por la prueba t. (C) Análisis de transferencia Western que muestra que MTMR14 tiende a acumularse con la edad en muestras de corteza humana. Se utilizó GAPDH como control interno. (C') Cuantificación de los niveles de proteína EDTP en grupos de edad media y avanzada, determinada por el análisis de transferencia Western (C). *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Para las estadísticas, consulte la Tabla S1. (D) El análisis de RT-qPCR demuestra que los niveles de ARNm de MTMR14 aumentan con la edad en la corteza humana. Se utilizó GAPDH como control interno. Se compararon tres individuos de mediana edad (47 a 58 años) y tres ancianos (85 a 94 años). Los grupos son significativamente diferentes según la prueba U de Mann-Whitney; para obtener más información sobre las muestras, consulte la Tabla S5, ***P < 0,001. (E) Se realizó RT-qPCR para evaluar los niveles de ARNm de MTMR14 en muestras de corteza prefrontal. Se compararon 9 individuos jóvenes (1–3 años) y 6 individuos viejos (13–17 años) de varias razas (para obtener datos de muestra, consulte la Tabla S6). Se utilizaron ensayos TaqMan comerciales para apuntar al ortólogo canino MTMR14 (ThermoFisher, Cf02682018_g1). GAPDH (gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa) se utilizó como gen de referencia (Cf04419463_gH). En la gráfica, los recuadros representan el 50 % más típico de las muestras, las líneas indican la mediana, los bigotes superior e inferior muestran el 25–25 % restante de las muestras. Los círculos marcan valores atípicos. **P < 0,01, prueba t de dos muestras independientes. (F) Modelo que muestra cómo las fosfatasas lipídicas EDTP/MTMR14 influyen en el envejecimiento cerebral. La actividad de EDTP/MTMR14 (curva roja) aumenta gradualmente en las neuronas a lo largo de la vida adulta, lo que regula progresivamente a la baja la autofagia a medida que el organismo envejece (curva verde). Como consecuencia, el daño celular se acumula cada vez más con la edad en las neuronas (curva gris). Las líneas discontinuas verdes y grises indican niveles fisiológicos (basales) relativos de autofagia y actividad MTMR14/EDTP, respectivamente. La línea amarilla indica niveles relativos de 6 mA en el lugar geométrico de EDTP. En etapas adultas posteriores, las dos fosfatasas lipídicas actúan como factores pro-envejecimiento endógenos.

En células HeLa y C2C12 (mioblastos de ratón), se ha demostrado que MTMR14 se localiza en estructuras autofágicas22. Aquí probamos la cantidad de partículas positivas para MTMR14 en la corteza cerebral de pacientes humanos de diferentes edades. Usando un anticuerpo humano específico de MTMR14, se realizó un análisis inmunohistoquímico y los resultados demostraron que, de manera similar a lo que encontramos en Drosophila, las cantidades de estructuras marcadas con MTMR14 también aumentan con la edad en las neuronas cerebrales (Fig. 6B, B 'y Tabla S3). Estos resultados se confirmaron mediante un análisis paralelo aplicando otro anticuerpo específico de MTMR14 en un conjunto independiente de muestras de cerebro derivadas de pacientes sin demencia (Fig. S7A, A' y Tabla S4). Posteriormente, se realizó un análisis de transferencia Western para cuantificar los niveles de MMR14 soluble en muestras de la corteza cerebral humana, y observamos intensidades mucho más altas en muestras de edad avanzada (85 a 94 años) en relación con las de mediana edad (47 a 58 años) (Fig. .6C,C′, Fig. S7B y Tabla S5). Los niveles de transcripción de MTMR14 también se determinaron en estas muestras mediante un análisis de qPCR y, según los resultados, el gen se expresó en niveles más altos en las muestras viejas que en las jóvenes (Fig. 6D, Fig. S7C y Tabla S5). Por lo tanto, la regulación transcripcional de MTMR14 puede contribuir a niveles mejorados (actividad) del producto génico en edades avanzadas. Estos últimos resultados se correlacionan con los datos de expresión específicos de la corteza cerebral humana disponibles gratuitamente en GTExPORTAL (https://gtexportal.org), según los cuales MTMR14 se expresa cada vez más con la edad en ambos sexos (Fig. S7D).

Para revelar que la expresión de MTMR14 muestra un aumento relacionado con la edad en la corteza cerebral de otra especie de mamífero, finalmente determinamos los niveles de ARNm de MTMR14 en perros jóvenes versus perros mayores (Fig. 6E y Tabla S6). Los resultados mostraron que MTMR14 es más activo en animales viejos que en animales jóvenes. En conjunto, la actividad autofágica reducida en las neuronas a edades avanzadas en relación con la edad adulta joven puede ser una consecuencia del aumento de la acumulación de MTMR14 durante la vida.

En este estudio, demostramos que las proteínas p62 humana y Ref(2)P de Drosophila que sirven como sustrato para la degradación autofágica se acumulan progresivamente en el cerebro durante el envejecimiento (Figs. 1B,B″″,C,C′ y 6A,A′) . Este cambio gradual en los niveles de Ref(2)P/p62 indica una disminución relacionada con la edad en la capacidad de autofagia en este órgano, lo que explica por qué las neuronas acumulan cada vez más daño celular a lo largo de las etapas adultas tardías y se vuelven sensibles a la senescencia y, posteriormente, a la muerte. Además, demostramos que en edades avanzadas, la autofagia se ve afectada en dos etapas distintas. Primero, en una etapa temprana cuando se forma el fagóforo/autofagosoma (Fig. 1B–B″). En segundo lugar, en una etapa posterior cuando el autofagosoma se fusiona con un lisosoma o el contenido autolisosomal es degradado por hidrolasas ácidas (Fig. 1B-C″). Estos resultados sugieren que el deterioro de la autofagia durante el envejecimiento se debe, al menos en parte, a un mecanismo regulador (genético).

La autofagia juega un papel central en el control del envejecimiento2,3,4,44. Interviene en la eliminación de componentes citoplásmicos dañados y su actividad está influenciada por varias vías de longevidad, si no todas, como la señalización de insulina/IGF1 (factor de crecimiento similar a la insulina) y TOR (quinasa objetivo de la rapamicina), el sistema respiratorio mitocondrial , y el aparato molecular que subyace a la restricción calórica43. Los genes que regulan a la baja la autofagia en organismos envejecidos ciertamente contribuyen al deterioro de órganos y tejidos, promoviendo así el desarrollo de diversas enfermedades degenerativas asociadas con la edad. Sin embargo, el funcionamiento de estos sistemas reguladores depende en gran medida de factores ambientales, como la disponibilidad de alimentos, la concentración de oxígeno y la temperatura, e influye en la autofagia incluso en células que no envejecen, como la línea germinal y las células madre cancerosas, en las que no debería caer la degradación autofágica. apagado irrevocablemente. Proponemos que en el envejecimiento de las células somáticas, los factores endógenos específicos deberían establecer la velocidad a la que la capacidad de autofagia disminuye gradualmente durante el envejecimiento, en gran medida independientemente de las señales ambientales. Un factor de reloj molecular de este tipo que determina la velocidad a la que las células envejecen mediante la modulación de la actividad autofágica es Rubicon, que recientemente demostró suprimir progresivamente el proceso durante la vida adulta en taxones animales divergentes19.

¿Por qué la autofagia se deterioraría en numerosas neuronas en las etapas adultas tardías? Además de las mutaciones inactivantes aleatorias en los genes Atg, ciertos factores genéticos pueden regular negativamente la autofagia en adultos mayores. Demostramos que el gen EDTP, que codifica una fosfatasa lipídica relacionada con la miotubularina conservada que interfiere con la autofagia al antagonizar PI3K/Vps34 (Fig. 2A)23,25,34, también se expresa cada vez más en el cerebro durante la vida adulta (Fig. 4A, B). La proteína EDTP también parecía acumularse cada vez más con la edad en este órgano (Fig. 4C-C '). Su regulación a la baja en las neuronas desencadenó significativamente la autofagia, mejoró la locomoción y prolongó la vida útil (Fig. 5, Figura S3C-D 'y Fig. S4A'). De acuerdo con estos resultados, también se encontró que el MTMR14 humano se acumula en niveles más altos en las neuronas corticales humanas de pacientes de edad avanzada en comparación con los jóvenes (Fig. 6B-C ', Fig. S7A-B'). Además, la expresión de MTMR14 aumentó con la edad (Fig. 6D, Fig. S7C, D). En perros, MTMR14 se expresó de manera similar a niveles elevados en la corteza prefrontal del cerebro de adultos mayores en relación con los jóvenes (Fig. 6E). Juntos, de manera similar a Rubicon, EDTP y MTMR14 suprimen progresivamente la autofagia durante la vida19. Tanto EDTP como MTMR14 realizan esta función tanto en etapas tempranas como tardías del proceso autofágico (Fig. 1B-C″)22, mientras que Rubicon lo hace exclusivamente en esta última19. Con base en estos datos, se puede concluir que el complejo PI3K de clase III, que está regulado por la proteína EDTP/MTMR14, puede haber evolucionado como un reloj molecular primario donde la autofagia puede suprimirse de manera dependiente de la edad. Así, la actividad del complejo sirve como firma de envejecimiento.

El envejecimiento, una disminución natural en el estado físico y la fisiología general de un organismo a lo largo del tiempo, es impulsado por la acumulación progresiva de daño celular no reparado1,2,3,4,44. El proceso contribuye a la eliminación de los adultos posreproductivos de las poblaciones, disminuyendo así la competencia intraespecífica en condiciones de recursos limitados. Así, la aparición de factores genéticos que promueven el envejecimiento puede fortalecer la subsistencia a largo plazo de las especies a expensas de las vidas individuales. Como parte del envejecimiento del organismo, la desintegración gradualmente creciente de las funciones neuronales limita progresivamente la capacidad de supervivencia de los individuos. En este estudio, descubrimos un mecanismo regulador novedoso, por el cual el cerebro se deteriora a un ritmo cada vez mayor durante la vida adulta. Demostramos que Drosophila EDTP y MTMR14 humano, dos reguladores negativos conservados del proceso autofágico22,23,34, se acumulan progresivamente en las neuronas cerebrales a lo largo de la edad adulta (Figs. 4, 6B-C '). Por lo tanto, estas proteínas ortólogas, después de pasar por un nivel crítico de acumulación en las neuronas en una determinada etapa adulta, funcionan como factores endógenos a favor del envejecimiento que promueven el envejecimiento del cerebro y restringen la vida útil al disminuir cada vez más la autofagia con el tiempo (Fig. 6F). Debido a la disminución de la capacidad autofágica, las neuronas se vuelven progresivamente sensibles a acumular daño celular y, como consecuencia, a la muerte durante la vida adulta.

Las fosfatasas de lípidos MTMR conservadas EDTP y MTMR14 actúan como factores endógenos que disminuyen cada vez más la actividad autofágica durante la vida, lo que representa una nueva clase de factores reguladores endógenos pro-envejecimiento. La función de EDTP y MTMR14 en el control del envejecimiento parece ser similar a la de Rubicon19. En resumen, los datos presentados en este estudio revelan un mecanismo novedoso que impulsa el envejecimiento del cerebro. Sugerimos que la sensibilidad cada vez mayor de las neuronas a la muerte durante el envejecimiento está determinada genéticamente. El envejecimiento cerebral, al menos en parte, es un proceso regulado, y adquirir una condición neurodegenerativa es simplemente una cuestión de tiempo de vida del individuo.

Previamente, encontramos que tanto EDTP como Mtmr6, los ortólogos de moscas de los mamíferos MTMR14 y MTMR6-8, respectivamente, funcionan en el control de la autofagia21,45,46. Estas proteínas ejercen su función reguladora de manera dependiente de la condición en el cuerpo graso larval (etapa L3F); EDTP inhibe la autofagia basal pero no influye en la autofagia inducida por estrés, mientras que Mtmr6 promueve la autofagia basal pero inhibe el proceso en diversas condiciones de estrés. En los mamíferos, MTMR14 y MTMR8 convierten cada uno PI3P en PI, mientras que MTMR6 bloquea la generación de PI(3,5)P238. Tanto en condiciones de hambre como ricas en nutrientes, MTMR14 inhibe la autofagia, mientras que MTMR6 influye en la autofagia inducida por el hambre solo 22. Por lo tanto, MTMR14 y MTMR6 tienen funciones distintas en diferentes sistemas modelo. En el futuro, vale la pena estudiar la relación funcional de estas proteínas en el sistema nervioso adulto y en la determinación de la vida útil.

Las moscas se mantuvieron a 25 °C o 29 °C con nutrientes normales de harina de maíz para moscas. Las cepas se solicitaron a Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) y Drosophila Genetic Resource Center, Kyoto (DGRC), o fueron proporcionadas amablemente por otro investigador o generadas y descritas por nosotros anteriormente.

Para inmunohistoquímica y microscopía de fluorescencia, se utilizaron animales w[1118] (BDSC: 5905) y UAS-GFP-2xFYVE (II) (BDSC: 42712) (cruzados con Appl-Gal4), respectivamente. La expresión de GFP-Atg8a endógena se describió en la Ref.31.

Para el análisis de transferencia Western, se utilizó w[1118] como control. Para la sobreexpresión de EDTP, se utilizó EDTP[GSV6] (DGRC: 202239), bajo el control de Appl-Gal4 (BDSC: 32040). Se utilizó EDTP[MI008496] (BDSC: 44782) como alelo hipomórfico.

Animales de w[1118]; 3xmCherry-Atg8 es w[1118]; + ; Los genotipos UAS-GFP-Lamp1 fueron proporcionados por Gábor Juhász (Universidad Eötvös Loránd de Budapest, Hungría). Para ensayos de vida útil, y[1] v[1], Appl-Gal4; EDTP TRiP /tubGal80[ts] y y[1] sc[*]v[1], Appl-Gal4; Los animales eGFP TRiP /tubGal80[ts] (control) se crearon cruzando Appl-Gal4, tubGal80[ts];TM2/TM6B (BDSC: 7108), eGFPTRIP (V22) (BDSC: 41550) y EDTP TRIP (V22) (BDSC : 41633) animales. En el caso de otro ensayo de vida útil, y para ensayos de escalada, los animales con w[1118]/+; +; pleGal4/+ y w[*]/+; +; Los genotipos UAS-EDTP-RNAi/pleGal4 se crearon cruzando pleGal4 (BDSC: 8848), w[1118], eGFPTRiP (V22), EDTP TRiP (V22) y w[*]; Animales UAS-EDTP-RNAi (III), que fueron un regalo de Tamás Lukácsovich (Departamento de Biología Celular y del Desarrollo, Universidad de California, Irvine, CA, EE. UU.) y descritos en Manzéger et al.47. Las moscas se mantuvieron a 29 °C y los animales muertos se contaron diariamente.

Para las mediciones de la vida útil, los ensayos de escalada y las pruebas de ubiquitinación de proteínas, se utilizaron dos construcciones de ARNi diferentes para regular a la baja la expresión de EDTP. BDSC: la cepa 41633 (EDTP-RNAi(V22)) contiene una secuencia objetivo más corta: CAG TAG TGT AAT AGT AAT CAA (Fig. S2B), mientras que la otra construcción (EDTP-RNAdsRNA) contiene una secuencia objetivo más larga pero diferente (Fig. S2B): ctc mordaza GGT ACC GGG AAA TGG ACT CTT CGG GCA AGT TGG GGG AGT GGG AGG TGG AGG CTC CTC GGG AAC AAC CGC CAC TGC CAC GCC TCT GAA CAG CAG TGC AGG AAG CAC CGG AAG TGA GGG TGT GGG CAT CCA AGC CTT TGT GAC CTT TGC CAA TCC CCT GCA GAC GCA ACA ACA GCA TCC GCT CCA GCA ACA ATA TCC CTC GCA GCA GAT GCA TCC CCT CCA CGC GCA ATA TCC CTC CCA GCA GCC ACA TCC ACT CCA GCA GCA GCA GCA GCA GCC ATC GCA ACA GCA ACC ACA AAA TAC GAT ATA CGA GGA TCA GTA TGA TAT CCA GCG AAT GCG GGA ATT GGT AAC GAT GGC CAA ATA TGC GAG ATG CCG TCA AAG ATT CGC CGT GCC TGT GAT TAT GTA TCG CGG AAA GTA CAT ATG CCG CTC TGC CAC GCT ATC CGT CAT GCC AGA AAC CTA CGG CCG AAA AGT GGT GGA CTA TGC CTA CGA CTG CCT GAG TGG CGG CAA TTA CAC CGC GCC AAA CGG AGA AGA GAA CGA TGC TGA CTC CAC GGA CGA GTC GCT GAT CAC CCA CAT GCA CGA CCA GGC GCA GTC GCA GTT CAG CTA CGA CGA AGT CAT CAA GAG TGA CAT CCA GCT GCT GCA TAC GCT CAA TGT CTC AAC CAT TGT GGA CCT CAT GGT CGA AAA CCG CAA AAT CAA ATA CTT CAT GGC aga tct.

Para estudiar la expresión de EDTP, y[1] w[*]; Mi{Trojan-GAL4.0}EDTP[MI08496-TG4.0]/ P{y[+ t7.7] w[+ mC] = 10XUAS-IVS-myr::GFP}su(Hw)attP5 y y[1 ] w[*]; Mi{Trojan-GAL4.0}EDTP[MI08496-TG4.0]/ P{w[+ mC] = UAS-GFP.nls}14 animales fueron creados cruzando EDTP TrojanGal4 (BDSC: 66899), UAS-myrGFP (BDSC : 32199) y UAS-GFPnls (BDSC: 4775). Para medir las estructuras autofágicas marcadas con mCherry-Atg8a, se aplicó el transgén UAS-mCherry-Atg8a, proporcionado amablemente por Gábor Juhász (Departamento de Anatomía, Biología Celular y del Desarrollo; Universidad Eötvös Loránd, Budapest, Hungría) y descrito en Ref.48.

Para determinar los niveles de Atg8a, se utilizó una construcción informadora GFP-Atg8a (p-Atg8a-eGFP-Atg8a)31. Las muestras se prefijaron con formaldehído al 4 % (disuelto en PBS) y se lavaron tres veces (durante 10 min) en PBS. Los núcleos se tiñeron con 50 µg de Hoechst en solución de cobertura de glicerol:PBS (4:1). Durante la medición, usamos el mismo tiempo de exposición y magnificación para todas las muestras.

La fijación y la inmunohistoquímica se realizaron de acuerdo con la Ref.46. Se usaron los siguientes anticuerpos: anti-Ref(2)P 1:200, conejo—un obsequio de Gábor Juhász, Departamento de Anatomía, Biología Celular y del Desarrollo, Universidad Eötvös Loránd, Budapest, Hungría49 y anti-Atg5 (1:500 , conejo, Sigma Aldrich, AV54267), anti-ubiquitina (1:500, ratón, Merck, ST1200). Se utilizaron los siguientes anticuerpos secundarios: anti-Rabbit Alexa Fluor 488 (1:500, Life Technologies, A11008), anti-Mouse Alexa Fluor 488 (1:500, Life Technologies, A11001). Los núcleos se tiñeron con colorante Hoechst (0,1 mg/ml, Molecular Probes, 33342).

Las imágenes fluorescentes se capturaron con un microscopio vertical Zeiss Axioimager Z1 (con objetivos Plan-NeoFluar 10 × 0.3 NA, Plan-NeoFluar 40 × 0.75 NA y Plan-Apochromat 63 × 1.4 NA) equipado con ApoTome y un microscopio confocal Nikon C2 (con objetivo 60 × Plan Petrolero APO VC NA = 1.45). Se utilizaron los software AxioVision 4.82 y Jmage J 1.52c para examinar y evaluar los datos obtenidos. Calculamos los coeficientes de Pearson por Image J 1.52c, para evaluar la colocalización de partículas mCherry-Atg8a y GFP-Lamp1.

Se prepararon muestras de transferencia Western a partir de 10 cabezas femeninas, que se trataron en 32 μl de tampón Fly Lysis + 32 μl de tampón 2 × Laemmli. Se corrieron muestras de 15 µl en gel Mini-PROTEAN® TGX™ al 4–20 % y se transfirieron a membrana de nitrocelulosa (Kisker Biotech, 40520100). Después de bloquear con leche en polvo al 3 % (BioRad 170-6404 /Blotting-Grade Blocker/) disuelta en TBST, las membranas se probaron con anticuerpos específicos [anti-tubulina (1:1000, ratón, Sigma T6199), anti-Ref(2) P (1:2000, conejo48), anti-Atg8a (1:2500, conejo50), anti-EDTP, 1:1000, rat22, anti-fosfatasa alcalina IgG de ratón (1:1000, Sigma, A8438) y anti-conejo Fosfatasa alcalina IgG (1:1000, Sigma, A3687), fosfatasa alcalina IgG anti-rata (1:1000, Sigma, A5153), y desarrollado por solución NBT-BCIP (Sigma, 72091). Cada análisis de transferencia Western se repitió al menos tres veces con muestras biológicas independientes.

El aislamiento del ARNm total de cabezas de moscas adultas a la edad de 1, 10, 20, 30, 40, 50 y 60 días se realizó de acuerdo con el protocolo del kit Direct-zol™ RNA MiniPrep (Zymo Research, R2050), luego se generó ADNc de RevertAid RT Reverse Transcription Kit (Thermo Scientific, K1691). Las reacciones de PCR en tiempo real cuantitativas se realizaron en un instrumento Roche LightCycler 96 (Roche Molecular Systems) con el kit FastStat Essential DNS Green Master (Roche, 06924204011). Las mediciones cuantitativas se repitieron tres veces utilizando muestras recién aisladas y cada experimento de qPCR contenía tres repeticiones técnicas. El nivel de ARNm de GAPDH se utilizó como control interno. Los cebadores directo (F) e inverso (R) fueron los siguientes: EDTP F: 5′-AAA AAG CTC CGG GAA AAG G-3′ y R: 5′-AAT TCC GAT CTT CGA CAT GGC-3′, GAPDH F: 5′-TAC TTC ATG GCC GTT TCC TC-3′ y R: 5′-AGA TCC CAA TCC CGG TAC TC-3′.

El ADN genómico se aisló de Drosophila en diferentes etapas adultas de acuerdo con los protocolos estándar (Kits de purificación de ADN genómico Thermo Scientific GeneJET #K0721 y #K0722). Las muestras se digirieron con DpnI a 37 °C durante 20 min, luego se inactivó la enzima a 80 °C durante 20 min, luego se realizó un experimento de PCR como se describió previamente por Yao et al.42. Los cebadores directo e inverso, y las condiciones de la PCR fueron las siguientes. Para Drosophila, control: 5′-TGA GGA ACA TCA TTC TTG GCT C-3′ y 5′-CTA CGG GGA GCT GAT GTA CT-3′; 6mA EDTP: 5′-ACC GTT AGG TCA GAT CTA TCC AG-3′ y 5′-CTA CGG GGA GCT GAT GTA CT-3′. PCR: 95 °C durante 30 s, luego 95 °C durante 10 s y 58,8 °C durante 30 s repetidos en 30/50 ciclos (control/muestra).

Se anestesiaron 20 moscas adultas (que se criaron a 29 °C) que expresaban el transgén bajo el control del conductor pleGal4 y se colocaron en una columna de vidrio vertical (longitud, 25 cm; diámetro, 1,5 cm). Después de 1 h de período de recuperación de la exposición al CO2, las moscas se golpearon suavemente 5 veces en el fondo de la columna. Se contó el número de moscas que alcanzaron la línea a 21,8 cm de altura en 20 s. En cada experimento se realizaron tres series de dos mediciones paralelas. Las puntuaciones representan el número medio de moscas que llegaron a la cima frente al número total probado. Los resultados se presentan como media ± DE

Para las mediciones de vida útil, se utilizó un número equivalente de hombres y mujeres. Los animales se transfirieron a viales nuevos que contenían nutrientes cada dos días. El número de animales muertos se contó diariamente. Las mediciones se realizaron con cinco paralelos. Las pruebas se llevaron a cabo a 25 y 29 °C.

Para el análisis estadístico de los ensayos de escalada, las mediciones de vida útil (vida útil media) y la microscopía de fluorescencia, los resultados se determinaron utilizando R Studio (Versión 3.4.3). La distribución de las muestras (normales o no) se probó con la prueba de Lilliefors. Si era normal, se realizaba la prueba F para comparar las varianzas. En los casos en que las varianzas eran iguales, se utilizó la prueba t de dos muestras; de lo contrario, se aplicó la prueba t para varianzas desiguales. En caso de distribución no normal, se realizó la prueba U de Mann-Whitney. Para el estadístico de la curva de vida útil se utilizó el método logrank (Mantel-Cox), calculado con el programa SPSS17.0.

Las proteínas ubiquitinadas en la vía autofágica-endocitótica y el deterioro de la autofagia se observaron mediante la localización inmunohistoquímica del anticuerpo anti-fosfatasa relacionada con miotubularina MTMR14, respectivamente. Después de la desparafinización y la rehidratación, las secciones se hirvieron en una solución tampón de citrato 0,01 M (pH 6,0) en un horno de microondas durante 2 min (ajustado a 900 vatios) para la recuperación del antígeno. Después de bloquear la peroxidasa endógena en TBS 0,1 M que contenía H2O2 al 3 % durante 10 min a 37 °C, las secciones se lavaron durante 3–5 min en TBS 0,1 M (pH 7,4) a temperatura ambiente. A continuación, se permeabilizaron las secciones de tejido y se redujo la unión de fondo de los anticuerpos en una solución de bloqueo (TBS 0,1 M que contenía suero de cabra normal al 5 %, BSA al 1 %, Triton X-100 al 0,05 %) durante 30 min a 37 °C. Las secciones se cubrieron con la solución anterior que contenía anticuerpo primario anti-NeuN de ratón (dilución final 1:500; Chemicon, Billerica, MA, EE. UU.), anticuerpo primario anti-MTMR14 policlonal de conejo (dilución final 1:100; ab102575, Abcam, Cambridge , Reino Unido) durante la noche a 4 °C. Después de la incubación con los anticuerpos primarios, las secciones se lavaron durante 4 × 5 min en TBS 0,1 M (pH 7,4) a temperatura ambiente. Se realizaron experimentos de control negativo cuando se omitió el anticuerpo primario apropiado. Luego, las secciones se trataron con anticuerpo secundario IgG anti-ratón o anti-conejo biotinilado (dilución final 1:200; Amersham Biosciences, Little Chalfont, Buckinghamshire, Inglaterra) en una solución de bloqueo (donde se omitió Triton X-100) durante 5 h. en RT. Después de varios lavados (4 × 5 min), se aplicó el anticuerpo terciario de estreptavidina-peroxidasa biotinilado (dilución final 1:200; Amersham) en una solución de bloqueo (sin Triton X-100) a las secciones durante la noche a 4 °C. Las secciones se lavaron nuevamente en TBS 0,1 M (pH 7,4) durante 4 × 5 min a temperatura ambiente y se procesaron para la histoquímica de la enzima peroxidasa utilizando Sigma Fast DAB Tablet (Sigma, St. Louis, MO, EE. UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las secciones se lavaron durante 3 × 5 min en TBS 0,1 M (pH 7,4) a temperatura ambiente, se enjuagaron con agua destilada durante 1 min, se deshidrataron en una serie de soluciones de etanol, se cubrieron con medio de montaje DPX (Fluka, 30 Buchs, Suiza) y se cubrieron con cubreobjetos. .

Se tomaron imágenes digitales de secciones de cortezas temporales de 4 sujetos sin demencia (consulte la Tabla S4 para conocer las edades, los sexos, los retrasos post mortem y las etapas de Braak) inmunoteñidas para NeuN con un microscopio óptico Leica DMLB (Leica Microskopie und Systeme GmbH; Wetzlar, Alemania) utilizando una cámara digital Qimage MicroPublisher 3.3 RTV (Surrey, BC, Canadá). Las células positivas para NeuN (no mostradas) se contaron con el uso del programa informático ImageJ (versión 1.47; desarrollado por W. Rasband en los Institutos Nacionales de Salud de EE. UU. y disponible en Internet en http://rsb.info.nih. gov/ij) como publicamos anteriormente (para más detalles, consulte las Refs.35,51. Las inmunorreactividades de MTMR14 se cuantificaron en citoplasma libre de lipofuscina mediante el uso del software de procesamiento de imágenes ImageJ. Se analizó un total de 134 células de muestras sin demencia. Mediciones fueron tomadas por dos investigadores independientes y se promediaron los valores de densidad.

La distribución de proteínas se midió mediante técnicas de inmunofluorescencia, usando el método de amplificación de señal de fluoróforo-tiramida (Perkin Elmer, Waltham, MA, EE. UU.). Se utilizó un sistema de tinción automatizado BOND‐RX (Leica Biosystems, Wetzlar, Alemania) para preparar los portaobjetos para la tinción. Las secciones se "hornearon" (30 min a 60 °C), se desparafinaron con Bond Dewax Solution (Leica Biosystems, 72 °C) y se sometieron a un paso de recuperación de epítopo inducido por calor (solución basada en EDTA, pH 9,0, 20 min a 100 °C).

Después de este "pretratamiento", los portaobjetos se lavaron manualmente en solución salina tamponada con fosfato (PBS), se incubaron en H2O2 al 0,03 % durante 30 minutos para bloquear la peroxidasa endógena y se lavaron nuevamente. Anticuerpo primario de conejo producido contra SQSTM1 humano (HPA003196, Atlas Antibodies, Estocolmo, Suecia) diluido 1:10 en tampón de anticuerpo primario (0,3 % TX‐100, 0,1 % NaN3, PBS) y agregado a los portaobjetos para incubación durante la noche en una cámara humidificada a 4 °C. Al día siguiente, los portaobjetos se lavaron en solución salina tamponada con Tris (TBS, pH 7,4) – Tween 20 y se bloquearon en tampón de bloqueo Tris-NaCl (TNB) (0,1 mol/L Tris-HCl, pH 7,5, 0,15 mol/L NaCl , reactivo de bloqueo al 0,5 %, Perkin Elmer) durante 30 min. El anticuerpo secundario conjugado de HRP anti-conejo porcino (DAKO) diluido 1:200 en TNB se aplicó a los portaobjetos durante 30 minutos, seguido de un lavado en TBS-Tween 20. Para la señal de tiramida, los portaobjetos de amplificación se incubaron con tiramida conjugada con fluoresceína. diluido (1:100) en reactivo de amplificación (Perkin Elmer) durante 15 min a temperatura ambiente.

Para apagar la autofluorescencia de la lipofuscina en el tejido, los portaobjetos se contrastaron con una solución lipófila de negro de Sudán B (1 % p/v en etanol al 70 %, Sigma‐Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) durante 5 min. A continuación, los portaobjetos se sumergieron en etanol al 70 % seguido de un lavado con PBS y se cubrieron con un medio de montaje acuoso que contenía una contratinción de 4′,6‐diamidino‐2‐fenilindol (DAPI) (ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.). A menos que se indique lo contrario, todos los pasos se ejecutaron a temperatura ambiente.

Las imágenes se adquirieron en un sistema automatizado de escaneo de diapositivas VSlide (Metasystems, Altlussheim, Alemania). Se tomaron imágenes de piezas enteras de tejido en los portaobjetos con un objetivo de 20 × (NA = 0,45, resolución de 3,6 píxeles/μm). Cada campo de visión se capturó en 3 niveles z con un intervalo de 1 μm para crear una imagen de enfoque extendido. Las imágenes del campo de visión adquiridas se unieron para crear una visión general completa con resolución microscópica. Los espectros de emisión para los anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforo fueron los siguientes: Hoechst (420–485 nm), Cy2 (490–530 nm), Cy3 (550–570 nm), Cy3.5 (580–595 nm) y Cy5 (650–670 nanómetro).

Las muestras de ARNm humano total se aislaron de los tejidos corticales temporales de acuerdo con el protocolo del kit Direct-zol™ RNA MiniPrep (Zymo Research, R2050), luego se generó ADNc con el kit de transcripción inversa RevertAid RT (Thermo Scientific, K1691). Se utilizó el instrumento Roche LightCycler 96 (Roche Molecular Systems) con el kit FastStat Essential DNS Green Master (Roche, 06924204011) para las reacciones cuantitativas de PCR en tiempo real. Se utilizó GAPDH como control interno. Se utilizaron los siguientes cebadores directos e inversos: GAPDH: 5′-TCG GAG TCA ACG ATT TGG T-3′ y 5′-TTC CCG TTC TCA GCC TTG AC-3′, MTMR14: 5′-GTA ACG GGC TGT GGC AGT AT-3′ y 5′-TTC CCG TTC TCA GCC TTG AC-3′.

Las proteínas se aislaron de los tejidos corticales temporales de acuerdo con el protocolo estándar de preparación de muestras para Western blot de Abcam. Se homogeneizaron 15 mg de tejido por cada muestra en 600 µl de tampón de lisis (incluidos tampón RIPA e inhibidores de proteasa y fosfatasa) con homogeneizador eléctrico. Se corrieron muestras de 20 µl en gel Mini-PROTEAN® TGX™ al 4–20 % y se transfirieron a membrana de nitrocelulosa (Kisker Biotech, 40520100). Después de bloquear con Leche en Polvo al 3% (BioRad 170-6404 /Blotting-Grade Blocker/) disuelta en TBST, las membranas se probaron con anticuerpos específicos [anti-GAPDH (1:2000, conejo, Sigma G9545), anti-MTMR14 (1: 500, conejo, Abcam ab102575), fosfatasa alcalina IgG anti-conejo (1:1000, Sigma, A3687), y desarrollado por solución NBT-BCIP (Sigma, 72091).

Se obtuvo tejido cortical temporal humano de control de cinco hombres y una mujer (SKO20: 27 años, SKO7: 55 años, SKO19: 61 años, SKO11: 77 años, SKO16: 72 años). años, SKO18: 85 años) los sujetos fallecieron por causas no relacionadas con ninguna enfermedad cerebral, y no tenían antecedentes de ningún trastorno neurológico. Los sujetos de control fueron procesados ​​para la autopsia en el Departamento de Patología, Hospital Saint Borbála, Tatabánya, Hungría. Los tejidos se obtuvieron y utilizaron de acuerdo con la Declaración de Helsinki. Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Regional e Institucional de Ciencia y Ética de la Investigación del Consejo Científico de la Salud, de conformidad con la Ley Húngara (ETT TUKEB 15032/2019/EKU).

Las muestras de cerebro se extrajeron 2–4, 5 h después de la muerte, se canularon las arterias carótida interna y vertebral y se perfundieron primero con solución salina fisiológica (1,5 l en 30 min) que contenía 5 ml de heparina, seguida de una solución fijadora que contenía 4%. paraformaldehído, glutaraldehído al 0,05% y ácido pícrico al 0,2% en PB 0,1 M, pH 7,4 (4-5 l en 1,5-2 h). La corteza temporal se eliminó después de la perfusión y se fijó posteriormente en la misma solución fijadora durante la noche, pero sin glutaraldehído52. Posteriormente, se prepararon secciones coronales de 60 µm de espesor a partir de los bloques con un vibratomo Leica VTS-1000 (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania) para inmunohistoquímica. Las secciones se lavaron en PB y se sumergieron en sacarosa al 30% durante 1 a 2 días, luego se congelaron y descongelaron tres veces sobre nitrógeno líquido. Las secciones se procesaron para la inmunotinción de la siguiente manera: después de lavarse minuciosamente en PB cinco veces, la actividad de la peroxidasa endógena se bloqueó con H2O2 al 1 % en solución salina tamponada con TRIS (TBS, pH 7,4) durante 10 min. Se usó TBS para todos los lavados (3 × 10 min entre cada antisuero) y para la dilución de los antisueros. Para investigaciones microscópicas confocales, la incubación de anticuerpos primarios ocurrió simultáneamente (anti-MTMR14, conejo, 1:500; ABCAM, #ab102575), anti-NeuN, ratón, 1:2000; Merck, #Ab377). Después de la incubación, se aplicaron anticuerpos secundarios con fluoróforos (DAM Alexa488 1:500; Thermofisher, #A-2107, DAR Alexa594 1:500; Thermofisher, #A-2102) durante 3 h, luego las muestras se incubaron con fluoróforo DAPI (1: 10,000, Sigma-Aldrich, #D9564) por 2 h. Para reducir la autofluorescencia, las muestras se incubaron con una solución de CuSO4 durante 40 min o las muestras se trataron con AER (reactivo eliminador de autofluorescencia; Merck, n.° 2160) en etanol al 70 % durante 5 min. Después de eso, las muestras se montaron en Aqua-Poly/Mount (Polysciences, #18606-20). Para evitar cualquier interacción con productos químicos adicionales que provoquen una reducción de la intensidad fluorescente, la medición cuantitativa se llevó a cabo sin AER. Las muestras se analizaron utilizando un microscopio fluorescente confocal Nikon C2 con objetivos de aceite de 60 ×. Las áreas de ROI (región de interés) se definieron a partir del ancho total de la capa cortical 3 de las secciones corticales temporales (área 38 de Brodmann). Las células marcadas con NeunN se fotografiaron en su mayor extensión pericarial. Con este método, ca. Se fotografiaron 30 células de la capa 3d de cada muestra cortical. Las imágenes confocales fluorescentes triples de NeuNm/MTMR14r/DAPI se analizaron mediante el programa ImageJ 1.50b. Durante las mediciones, los tres canales (verde: 488 nm; rojo: 594 nm; azul: DAPI 470 nm) se visualizaron por separado. Las áreas de citoplasma sin núcleo o lipofuscina autofluorescente se determinaron utilizando los canales NeuN (verde) y DAPI (azul). En estas celdas, se designaron una o dos áreas de ROI de 2 a 4 µm2. La intensidad se midió en áreas ROI en el canal rojo correspondiente al inmunomarcaje de MTMR14. Aunque los parámetros de imagen eran uniformes, los valores de intensidad absoluta no eran comparables debido a las diferencias individuales en las muestras, por lo que se determinó una unidad de intensidad relativa (UI) para cada célula individual. Como intensidad de referencia, se utilizó la intensidad relativa (medida como se describe anteriormente) de las células gliales adyacentes a las neuronas. La intensidad relativa se calculó con base en la siguiente fórmula: IU = (AI-RI)/(MI-RI) × 100, donde AI es la intensidad absoluta medida en el citoplasma de las neuronas, RI es la intensidad de referencia, MI es la más alta intensidad encontrada en la imagen. Para imágenes sin células gliales identificables, se utilizó para el cálculo el promedio de los valores de RI de las imágenes del sujeto. Para las estadísticas se utilizó el programa de diagramas Statistica 13.4 Microsoft Excell. Los seis sujetos se dividieron en dos grupos, como "jóvenes" que contenía sujetos de 27, 55 y 61 años frente a "viejos" que contenía sujetos de 72, 77 y 85 años. La normalidad de los valores de UI obtenidos se comprobó mediante la prueba de Kolmogorov-Smirnov. Según los valores de P > 0,2, los datos se distribuyeron normalmente, por lo que los datos de las unidades de intensidad agrupadas de los dos grupos se compararon mediante la prueba T.

El ARN total se aisló de muestras corticales frontales caninas almacenadas congeladas en RNAlater (Thermo Fisher Scientific, n.° AM7021), mediante el uso de TRIzol (ThermoFisher Scientific, n.° 15596018), según las instrucciones del fabricante. Antes de sumergir las piezas de tejido en TRIzol, cada pieza se enjuagó en 1 ml de PBS estéril en un tubo nuevo y se centrifugó durante 5 min a 500 g. Se añadió TRIzol a las muestras después de eliminar el PBS. Las piezas de tejido se homogeneizaron en TRIzol mediante un homogeneizador Ultra-Turrax (Ika). Después de la homogeneización, tuvo lugar el aislamiento del ARN. La calidad de los aislamientos se verificó mediante electroforesis en gel de agarosa y las concentraciones se midieron mediante un dispositivo NanoDrop (ThermoFisher Scientific). Las muestras de ARN aislado se almacenaron a -20 °C antes de la síntesis de ADNc y a -80 °C para el almacenamiento a largo plazo.

Se transcribieron inversamente 1000 ng de ARN total en ADNc, usando el kit de síntesis de ADNc Maxima RevertAid (Thermo Fisher Scientific, #K1672). Se realizó la transcripción inversa utilizando cebadores de hexámeros aleatorios. Luego, las muestras de ADNc se diluyeron diez veces en agua libre de nucleasas y se mantuvieron a -20 °C oa -80 °C. Las reacciones de PCR en tiempo real cuantitativas se realizaron en un instrumento Roche LightCycler 96 (Roche Molecular Systems), utilizando ensayos comerciales TaqMan y TaqMan Gene Expression Master Mix (Thermo Fisher Scientific, n.º 4369514). Los ortólogos caninos de MTMR14 y GAPDH (control interno) son Cf02682018_g1 y Cf04419463_gH, respectivamente. Las reacciones se realizaron por triplicado en placas de 96 pocillos.

Los procedimientos que implican la experimentación con animales vertebrados se realizaron de acuerdo con la guía de la Universidad Eötvös Loránd, Budapest, Hungría. Confirmamos que los estudios presentados en el manuscrito se llevaron a cabo de conformidad con las directrices ARRIVE.

La manipulación de muestras de cerebro humano y animal se realizó de acuerdo con las directrices del Comité de Experimentación Humana de la Universidad de Szeged, Facultad de Medicina y Facultad de Ciencias e Informática (Szeged, Hungría), así como del Instituto de Medicina Experimental, Academia Húngara de Ciencias. (Budapest, Hungría), en el que se realizaron los experimentos. Confirmamos que se obtuvo un consentimiento informado de todos los sujetos y/o su tutor legal (para usar sus datos en nuestro manuscrito).

La manipulación de muestras de cerebro humano y animal se realizó de acuerdo con las directrices del Comité de Experimentación Humana de la Universidad de Szeged, Facultad de Medicina y Facultad de Ciencias e Informática (Szeged, Hungría), así como del Instituto de Medicina Experimental, Academia Húngara de Ciencias. (Budapest, Hungría), en el que se realizaron los experimentos. Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

Relacionado con la autofagia

Coiled-coil, proteína que interactúa con BCL2 similar a la miosina

Fosfatasa derivada de huevo

Fab 1 (ortólogo de levadura de PIKfyve) YOTB, Vac 1 (proteína de transporte de vesículas) y EEA1

Proteína fluorescente verde

factor de crecimiento similar a la insulina

Proteínas asociadas a microtúbulos 1A/1B cadena ligera 3B

miotubularina

Relacionado con miotubularina

Fosfatidilinositol

Clase III fosfatidilinositol 3-quinasa

Fosfatidilinositol 3-fosfato

Fosfatidilinositol 3,5-bisfosfato

Rubicon (dominio RUN y dominio rico en cisteína que contiene proteína que interactúa con Beclin 1)

Sequestosoma 1

Objetivo de la rapamicina

Gen asociado a la resistencia a la radiación ultravioleta

Clasificación de proteínas vacuolares 34

N6-metiladenina

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Este trabajo fue apoyado por las subvenciones OTKA (Fondo Húngaro de Investigación Científica) K109349 y K132439 a TV, Programa de Sinergia de Investigación Científica de Proteínas MEDinPROT (proporcionado por la Academia Húngara de Ciencias; HAS) a TV, la Unión Europea y el Estado de Hungría, co -financiado por el Fondo Europeo de Desarrollo Regional (VEKOP-2.3.2-16-2017-00014) para TV, GINOP 2.3.2-15-2016-00034 para KG, ERC Starting (680040) y Bolyai (HAS) para EK. y Programa Nacional de Investigación del Cerebro (2017-1.2.1-NKP-2017-00002) a ZM. El estudio fue apoyado por la Academia Húngara de Ciencias a través de una subvención al Grupo de Investigación de Animales de Compañía 'Lendület/Momentum' de MTA-ELTE (Subvención no. PH1404/21) y el Programa Nacional del Cerebro 3.0 (NAP2022-I-3/2022) a E.K. VB y TV fueron apoyados por ELKH-ELTE Genetics Research Group (01062). Este trabajo se completó en el Programa de Excelencia Institucional ELTE apoyado por la Oficina Nacional de Investigación, Desarrollo e Innovación (NKFIH-1157-8/2019-DT). MP recibió el apoyo del Programa Húngaro de Investigación del Cerebro (2017-1.2.1. NKP-2017-00002). Los tejidos humanos fueron proporcionados parcialmente por el Hospital Saint Borbala, Tatabánya, Hungría, y el Laboratorio de Investigación del Cerebro Humano, Instituto de Medicina Experimental, HAS, Budapest, Hungría.

Estos autores contribuyeron por igual: Tibor Kovács y Janka Szinyákovics.

Departamento de Genética, Universidad ELTE Eötvös Loránd, Péter Pázmány Stny. 1/C, Budapest, 1117, Hungría

Tibor Kovács, Janka Szinyakovics, Viktor Billes, Gábor Murányi, Virginia B. Varga & Tibor Vellai

Grupo de Investigación en Genética MTA-ELTE, Budapest, 1117, Hungría

Viktor Billes y Tibor Vellai

Departamento de Biología Celular y Medicina Molecular, Universidad de Szeged, Szeged, 6720, Hungría

Annamária Bjelik, Ádám Légrádi, Melinda Szabó & Károly Gulya

Departamento de Etología, Universidad ELTE Eötvös Loránd, Budapest, 1117, Hungría

Sándor Sara y Enikő Kubinyi

Laboratorio de Investigación del Cerebro Humano, Instituto de Medicina Experimental, ELKH, Budapest, 1085, Hungría

Cecília Szekeres-Paracky, Péter Szocsics y Zsófia Maglóczky

János Szentágothai Doctoral School of Neuroscience, Universidad Semmelweis, Budapest, 1085, Hungría

Cecília Szekeres-Paracky & Péter Szocsics

Departamento de Psiquiatría, Hospital Saint Borbala, Tatabánya, 2800, Hungría

János Lőke

Laboratorio Science for Life, Departamento de Neurociencia, Instituto Karolinska, 171 77, Estocolmo, Suecia

junio mulder

Escuela de Medicina Lee Kong Chian, Universidad Tecnológica de Nanyang, Singapur, 636921, Singapur

Balázs Gulyás

Laboratorio y banco de tejido cerebral humano, Universidad Semmelweis, Budapest, 1085, Hungría

Éva Renner y Miklós Palkovits

Grupo de investigación de animales de compañía MTA-ELTE Lendület "Momentum", Budapest, Hungría

Eniko Kubinyi

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TK diseñó y realizó experimentos en Drosophila y muestras humanas, analizó datos y escribió el manuscrito; JS realizó experimentos con Drosophila y muestras humanas, analizó datos; VB realizó varios experimentos en Drosophila, GM participó en el análisis de la expresión de EDTP; VBV realizó experimentos en Drosophila; AB, A.L. y MS realizó el análisis de expresión de p62 y MTMR14 en muestras de cerebro humano; SS realizó el análisis de expresión de MTMR14 en muestras de cerebro de perro; CS-P. y PS realizó la cuantificación de los niveles de acumulación de MTMR en muestras de cerebro humano; JL proporcionó y analizó muestras de tejido cerebral humano; MP y ER realizaron microdisección de áreas corticales cerebrales humanas; JM realizó el análisis de la acumulación de p62 en muestras de cerebro humano post mortem; EK, BG, KG, ZM y TV diseñaron experimentos, analizaron datos y escribieron el manuscrito.

Correspondencia a Károly Gulya, Zsófia Maglóczky o Tibor Vellai.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Kovács, T., Szinyákovics, J., Billes, V. et al. Una fosfatasa lipídica MTMR conservada suprime cada vez más la autofagia en las neuronas cerebrales durante el envejecimiento. Informe científico 12, 21817 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-24843-w

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Recibido: 01 Diciembre 2021

Aceptado: 21 de noviembre de 2022

Publicado: 17 diciembre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-24843-w

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