ACSS2

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 1483 (2023) Citar este artículo

1001 Accesos

1 Citas

1 Altmetric

Detalles de métricas

La alcaliptosis es un tipo de muerte celular dependiente del pH descubierto recientemente que se utiliza para la terapia tumoral. Sin embargo, sus mecanismos moleculares subyacentes y sus redes reguladoras son en gran parte desconocidos. Aquí, informamos que el miembro 2 de la familia de la sintasa de cadena corta (ACSS2) de la enzima activadora de acetato acetil-CoA es un regulador positivo de la alcaliptosis en las células de adenocarcinoma ductal pancreático humano (PDAC). Usando qPCR y análisis de transferencia Western, encontramos que la expresión de ARNm y proteína de ACSS2 estaba regulada positivamente en líneas celulares PDAC humanas (PANC1 y MiaPaCa2) en respuesta al activador de alcaliptosis clásico JTC801. En consecuencia, la eliminación de ACSS2 por parte de los shRNA inhibió la muerte celular inducida por JTC801 en células PDAC y estuvo acompañada por un aumento en la formación de clones celulares y una disminución en el pH intracelular. Mecánicamente, la producción de acetil-coenzima A mediada por ACSS2 y la subsiguiente acetilación de histonas contribuyeron a la regulación negativa de CA9 dependiente de NF-κB, y este efecto fue mejorado por el inhibidor de histona desacetilasa tricostatina A. Estos hallazgos pueden proporcionar nuevos conocimientos para comprender la base metabólica de la alcaliptosis. y establecer una estrategia potencial para el tratamiento de PDAC.

Hay muchos tipos diferentes de muerte celular regulada (RCD), que muestran características morfológicas, bioquímicas y genéticas significativas1. La apoptosis es la forma más estudiada de RCD. Implica la formación de cuerpos apoptóticos unidos a la membrana y generalmente está mediada por la familia de las caspasas. Sin embargo, la resistencia a la apoptosis sigue siendo un desafío clínico importante para el tratamiento del cáncer2. Recientemente, se ha informado que varias formas de muerte celular no apoptótica superan la tolerancia apoptótica para tratar varios tipos de cáncer3. Entre ellos, la alcaliptosis es un RCD dependiente del pH que se identificó por primera vez a través de la detección de fármacos para matar células de adenocarcinoma ductal pancreático humano (PDAC)4. El compuesto de molécula pequeña JTC801 es actualmente un inductor de alcaliptosis típico, que se basa en la activación del factor nuclear kappa B (NF-κB), en lugar de realizar su conocida función como antagonista selectivo de los receptores de péptidos del dolor4. La activación de NF-κB mediada por JTC801 inhibe la expresión de la anhidrasa carbónica 9 (CA9), cuyo producto regula el equilibrio del pH y, en última instancia, conduce a la alcalitosis con ruptura de la membrana plasmática4. Una mayor comprensión del mecanismo y la regulación de la homeostasis del pH puede mejorar la actividad anticancerígena de la terapia basada en alkaliptosis5.

La acetil-coenzima A (AcCoA) es un metabolito que juega un papel central en la producción de energía, el metabolismo de los lípidos y la modificación del epigenoma6. La homeostasis de AcCoA afecta directamente el nivel de acetilación de histonas, regulando así la expresión génica7. AcCoA generalmente se produce a través de dos vías6. Uno está mediado por ATP citrato liasa (ACLY), que escinde el ácido cítrico en oxaloacetato y acetil-CoA. El otro está mediado por la familia de acetil-CoA sintasa de cadena corta (ACSS), que liga acetato y CoA. La familia ACSS incluye ACSS1, ACSS2 y ACSS3, que tienen diferentes ubicaciones y funciones subcelulares. ACSS1 y ACSS3 se localizan principalmente en las mitocondrias y participan en la fosforilación oxidativa mitocondrial, mientras que ACSS2 se localiza principalmente en el núcleo y el citoplasma8. El ACSS2 nuclear recaptura el acetato liberado por la desacetilación de histonas para que la histona acetiltransferasa9 lo recicle. ACSS2 utiliza acetato para proporcionar AcCoA para la lipogénesis de novo y la acetilación de histonas10. Aunque ACSS desempeña un papel en la regulación de la supervivencia y la apoptosis de varias células cancerosas11,12, su papel en la alcaliptosis aún es incierto.

En este estudio, identificamos un nuevo papel de ACSS2 en la mediación de la alcaliptosis en células PDAC humanas al mantener la activación de NF-κB y, posteriormente, regular al alza el pH intracelular a través de la acetilación de histonas. Estos hallazgos refuerzan la idea de que las señales cancerígenas o favorables a la supervivencia pueden usarse para desencadenar la muerte celular.

Los anticuerpos contra ACSS2 (3658), GAPDH (5174), p-IKKα/β (2697), IKKα (11930), p-NF-κB (3033), IKBα (7217), lisina acetilada (9814), IKKβ ( 8943), NF-κB (16502), p-IKBα (2859) y CA9 (5648) se obtuvieron de Cell Signaling Technology. El anticuerpo contra PARP (13371-1-1-ap) se obtuvo de Proteintech. JTC801 (S272201) se adquirió de Selleck Chemicals. La estaurosporina (62996-74-1) y la tricostatina A (58880-19-6) se adquirieron de MedChemExpress.

Las líneas celulares PANC1 (CRL-1469), MiaPaCa2 (CRL-1420) y CFPAC-1 (CRL-1918) se obtuvieron de la American Type Culture Collection. Las células se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco con suero bovino fetal al 10%, l-glutamina 2 mM y 100 U/ml de penicilina y estreptomicina. El cultivo celular se colocó en una incubadora a 37 °C con dióxido de carbono al 5%. Las líneas celulares se validaron mediante perfiles repetidos en tándem cortos y las pruebas de micoplasma de rutina dieron negativo para la contaminación. Se usó dimetilsulfóxido (DMSO) para preparar la solución madre de fármacos. La concentración final de DMSO en la solución de trabajo del fármaco en las células fue <0,01 %. Se utilizó DMSO al 0,01 % como vehículo de control en todos los ensayos de cultivo celular13.

La hibridación de matrices se realizó de acuerdo con el protocolo de análisis de expresión génica basado en micromatrices de un solo color de Agilent (Agilent Technology)14. La cantidad y la calidad del ARN se midieron con NanoDrop ND-1000. La integridad del ARN se evaluó mediante electroforesis en gel de agarosa desnaturalizante estándar. El ARNm se purificó a partir del ARN total después de la eliminación del ARNr utilizando el kit de aislamiento de ARNm eucariótico SOLO ARNm (Epicentre). El ARN total (100 ng) aislado de cada muestra se convirtió en ADNc, se fragmentó y se hibridó con matrices GeneChip. Las matrices de hibridación se lavaron, fijaron y escanearon con el escáner de microarrays de ADN de Agilent (P/N G2505C). El escáner GeneChip 3000 (Affymetrix) se utilizó para escanear y cuantificar imágenes de matrices GeneChip híbridas. El valor de intensidad para cada celda de sonda en la matriz se calculó mediante el software GeneChip.

El ACSS2-shRNA-1 humano prediseñado (GCTTCTGTTCTGGGTCTGAAT), ACSS2-shRNA-2 (CGGTTCTGCTACTTTCCCATT) y el shRNA vacío de control (pLKO.1) se compraron de Sigma-Aldrich en un formato lentiviral. Sembramos 1 × 105 células en cada pocillo de una placa de 12 pocillos en 500 μl de medio completo y las transducimos mediante vectores lentivirales a una MOI de 10:1. La transducción se llevó a cabo en presencia de polibreno (8 µg/ml). Después de recuperar con medio de cultivo completo, se utilizó puromicina (5 µg/ml) para la selección de las células transducidas13.

Las células se lisaron a 4 °C en tampón RIPA enfriado con hielo (9806, Cell Signaling Technology) y los lisados ​​celulares se aclararon mediante centrifugación breve (13 000 × g, 15 min, 4 °C). El sobrenadante se usó para la inmunoprecipitación con los anticuerpos indicados. En general, se añadieron 2 mg de anticuerpo al sobrenadante y se incubó a 4 °C durante la noche. Luego, se añadieron 30 μl de proteína G o suspensión de sefarosa A, y la muestra se incubó durante 2 h más a 4 °C. Después de la incubación, las perlas se lavaron extensamente con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y las proteínas se eluyeron hirviéndolas en tampón de muestra de dodecilsulfato de sodio 2 × antes de la electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio4.

Las células se lisaron 1 × en tampón de lisis celular (Cell Signaling Technology, 9803) con cóctel inhibidor de proteasa y fosfatasa (Cell Signaling Technology, 5872) en hielo durante 30 min13. Después de centrifugar a 14 000 × g durante 15 min a 4 °C, los sobrenadantes se recolectaron y cuantificaron mediante un ensayo de ácido bicinconínico (BCA) (Thermo Fisher Scientific, 23225). Los 30 µg de proteínas se separaron en geles de electroforesis en gel de poliacrilamida al 10 % (PAGE) (Epizyme, PG112) y se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF) (Millipore, IPVH00010). Después del bloqueo con TBST que contenía leche descremada al 5 % durante 1 h, las membranas se incubaron durante la noche a 4 °C con varios anticuerpos primarios (1:200–1:1000). Después de la incubación con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa (anticuerpo secundario IgG anti-cabra de conejo [Abcam, ab6741; 1:1000]) durante 1 h a temperatura ambiente, las señales se visualizaron utilizando el sustrato quimioluminiscente SuperSignal West Pico PLUS (Thermo Fisher Scientific, 34580 ). Las transferencias se analizaron utilizando el sistema de imágenes ChemiDoc Touch (Bio-Rad) y el software Image Lab (Bio-Rad). Todos los experimentos se realizaron al 5% de CO2 y normoxia y se repitieron al menos tres veces, se muestran los resultados representativos.

El nivel de viabilidad celular se ensayó utilizando un kit Cell Counting Kit-8 (CCK-8) (YEASEN, 40203ES80) según el protocolo del fabricante15. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos (1 × 104 células/pocillo) y se trataron con los compuestos indicados durante 24 h. Para cada pocillo de la placa, el medio se reemplazó con 100 µl de medio nuevo que contenía 10 µl de soluciones CCK-8. Luego, el cultivo se devolvió a la incubadora de células durante 60–90 min. La absorbancia a 450 nm fue proporcional al número de células vivas en el cultivo. La viabilidad celular se expresó como un nivel relativo y el 100 % de viabilidad celular se estableció como 1.

Para el ensayo clonogénico, se sembraron células de control o tratadas con JTC801 en placas de 12 pocillos (500 células por pocillo), luego se cambió el medio una vez cada 2 días. Las placas se incubaron a 37 °C durante 3 semanas hasta que aparecieron las colonias. A continuación, las células se fijaron con metanol y las colonias se tiñeron con cristal violeta al 0,4 %.

Las células se sembraron a una densidad de 2 × 105 células/pocillo en medio en placas de 6 pocillos. Al día siguiente, las células se incubaron con los tratamientos indicados. Posteriormente, las células se tiñeron con yoduro de propidio (BestBio, BB-4131-1) durante 20-30 min en una incubadora con CO2 al 5 % a 37 °C. Los cambios morfológicos se examinaron utilizando un microscopio de fluorescencia con un aumento de × 20. Se usó un contador de células automatizado Countess II FL (Thermo Fisher Scientific) para analizar los porcentajes de células muertas después de la tinción con yoduro de propidio. La muerte celular se expresó como un nivel relativo y el 100 % de muerte celular se estableció como 115.

El ARN total se extrajo utilizando un RNeasy Plus Micro Kit (QIAGEN, 74034) de acuerdo con las instrucciones del fabricante15. Los lisados ​​celulares se centrifugaron utilizando las columnas de centrifugación gDNA Eliminator del kit para eliminar el ADN genómico. El ARN total se purificó usando columnas giratorias RNeasy MinElute. A continuación, se sintetizó el ADNc de primera cadena a partir de 1 µg de ARN utilizando PrimeScript RT Master Mix (Takara, RR036A). Luego se prepararon 20 µl de reacciones combinando 4 µl de mezcla de reacción PrimeScript RT Master, 2 µl de solución potenciadora específica de genes, 1 µl de transcriptasa inversa, 1 µl de grupo de ensayo específico de genes (20 ×, 2 µM) y 12 µl de ARN diluido en agua libre de ARNasa, ADNasa y ADN genómico. Realizamos qPCR utilizando TB Green Premix Ex Taq II (Takara, RR820Q) en el C1000 Touch Thermocycler CFX96 Real-Time System (Bio-Rad). El análisis se realizó utilizando el software Bio-Rad CFX Manager 2.0. Los datos se normalizaron a ARN GAPDH y el cambio de pliegue se calculó mediante el método 2-DDCt. Las concentraciones relativas de ARNm se expresaron en unidades arbitrarias basadas en el grupo no tratado, al que se le asignó un valor de 1.

Para evaluar la tasa de apoptosis en células WT y ACSS2 konckdown después del tratamiento con estaurosporina (500 nM) o JTC801 (3 µM) durante 24 h, se recolectaron células y se usó el kit de tinción Active Caspase-3/7 (Abcam, ab284532) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. instrucciones. El pico de fluorescencia de Caspase-3/7 se analiza mediante citometría de flujo (BD FACSVerse, Becton, Dickinson and Company) utilizando el canal FL-1.

Para la tinción con PI de las muestras de células, las células se recogieron y se resuspendieron en tampón de unión (BD biosciences, nº 556570) y luego se tiñeron con yoduro de propidio (2 mg/ml). Los datos fueron recolectados y analizados en BD FACSVerse.

El pH extracelular se midió usando un medidor de pH (Seven Compact S210 pH/OPR meter, instrumento METTLER TOLEDO, EE. UU.) de acuerdo con las pautas del fabricante. El pH intracelular se determinó utilizando una sonda indicadora de pH citoplasmático fluorogénico (Thermo Fisher Scientific). La intensidad de fluorescencia de la sonda es entonces un indicador del pH intracelular. Es débilmente fluorescente a pH neutro pero cada vez más fluorescente a medida que desciende el pH. Este reactivo puede cuantificar el pH citosólico celular en el rango de 9–4 con un pKa de ~ 6,5 con excitación/emisión de 509/533 nm. El uso posterior del kit de tampón de calibración de pH intracelular (P35379) permite cuantificar este pH intracelular. Brevemente, las células se lavaron con Live Cell Imaging Solution (LCIS), luego se mezclaron 10 μl de pHrodo™ Red AM o pHrodo™ Green AM con 100 μl de concentrado PowerLoad™ y se agregaron a 10 ml de LCIS. Las células se incubaron con pHrodo™ AM/PowerLoad™/LCIS a 37 °C durante 30 min y luego se analizaron con el lector multimodo Cytation™ 5 Cell Imaging (BioTek, EE. UU.) con el 509/533 maxima4.

La acetil-CoA celular se midió usando el kit de ensayo de acetil-CoA (Sigma, MAK039) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Brevemente, a las células se les añadió ácido perclórico y se homogeneizaron. Después de la centrifugación (10 000 × g, 10 min, 4 °C), se neutralizaron 400 μl de sobrenadante con 40 μl de KHCO3 saturado y se centrifugaron a 10 000 × g durante 5 min a 4 °C. Se generó una curva estándar de acetil-CoA usando varias concentraciones (0–1000 pmol/ml) del estándar de acetil-CoA proporcionado. Los valores de fondo se eliminaron del estándar y la concentración de las muestras se calculó utilizando el lector multimodo de imágenes celulares Cytation™ 5 (BioTek, EE. UU.) utilizando los máximos 535/587.

Los datos se presentan como media ± SD excepto donde se indique lo contrario. GraphPad Prism (versión 8.4.3) se utilizó para recopilar y analizar datos. Se utilizaron pruebas de la t de Student para datos no apareados para comparar las medias de dos grupos. Se usó un análisis de varianza (ANOVA) de una vía (para una variable independiente) con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey para la comparación entre los diferentes grupos en todas las combinaciones por pares. Se utilizaron las siguientes notaciones en las cifras: *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001; ns: no significativo.

Las células cancerosas requieren una variedad de eventos de reprogramación metabólica para apoyar su supervivencia y rápida proliferación. Estas vías favorables a la supervivencia brindan oportunidades para diseñar nuevas estrategias para terapias dirigidas. Para determinar la base metabólica de la alcaliptosis, nos centramos en la glucólisis y el metabolismo de un carbono, que comparten factores reguladores del crecimiento de las células tumorales16. Después de analizar los resultados de la micromatriz de ADN de las células PDAC humanas (MiaPaCa2, PANC1 y CFPAC1) tratadas con JTC801, ACSS2 y el dominio hexoquinasa que contiene 1 (HKDC1) se regularon al alza los genes de la glucólisis y el metabolismo de un carbono en todas las líneas celulares (Fig. 1A ). El análisis posterior de qPCR confirmó que el ARNm de ACSS2 estaba regulado al alza en las células MiaPaCa2 y PANC1 después del tratamiento con JTC801 (Fig. 1B). Dado que ACSS2 está principalmente involucrado en el metabolismo de los lípidos, también usamos qPCR para examinar los genes clave del metabolismo de los lípidos. Otros genes relacionados con el metabolismo de los lípidos, como los de ACSS1, ácido graso sintasa (FASN), MYC, piruvato deshidrogenasa quinasa 1 (PDK1) y hexoquinasa 2 (HK2), así como anterior gradiente 2, miembro de la familia de proteínas disulfuro isomerasa (AGR2 ) también se regularon positivamente en diversos grados en células PANC1 o MiaPaCa2 (Fig. 1C). Además, el análisis de transferencia Western mostró que JTC801 indujo la regulación positiva de la proteína ACSS2 en células MiaPaCa2 y PANC1 de una manera dependiente de la dosis y el tiempo (Fig. 1D, E). Por el contrario, el nivel de proteína de ACSS2 no aumentó en las células PANC1 por la estaurosporina (un inductor de la apoptosis) (Fig. 1F). Juntos, estos hallazgos indican que ACSS2 aumenta durante la alcaliptosis en lugar de la apoptosis.

ACSS2 se regula positivamente durante la alcaliptosis. (A) Analizamos los genes regulados al alza involucrados en el metabolismo de la glucosa y el metabolismo del carbono en células de cáncer de páncreas (MiaPaCa2, PANC1 y CFPAC-1) a partir de estudios de micromatrices de ADN después de que las células se trataron con JTC801 (3 μM) durante 24 h. (B) Análisis qPCR del ARNm de ACSS2 y HKDC1 en células MiaPaCa2 y PANC1 tratadas con JTC801 (3 μM) durante 24 h (n = 3 muestras biológicamente independientes). (C) Análisis qPCR del ARNm de ACSS1, ACSS2, FASN, MYC, AGR2, PDK1 y HK2 en células MiaPaCa2 y PANC1 tratadas con JTC801 (3 μM) durante 24 h. (D) Análisis de transferencia Western de la expresión de la proteína ACSS2 en células MiaPaCa2 y PANC1 después del tratamiento con JTC801 indicado durante 24 h. La membrana se recortó y sondeó para los anticuerpos indicados. Los resultados cuantitativos se representan en el panel derecho. (n = 3 muestras biológicamente independientes, prueba t no pareada). (E) Análisis de transferencia Western de la expresión de la proteína ACSS2 en células MiaPaCa2 y PANC1 después del tratamiento con JTC801 (3 μM) durante 6–24 h (n = 3 muestras biológicamente independientes, prueba t no pareada). La beta-actina se probó como control de carga. Los resultados cuantitativos se representan en el panel derecho. (F) Análisis de transferencia Western de la expresión de proteína indicada en células MiaPaCa2 y PANC1 después del tratamiento con JTC801 (3 μM) o estaurosporina (500 nM) durante 24 h. La membrana de PARP fue despojada y reprobada para ACSS2. La membrana se incubó en solución de retransferencia durante 30 min y se bloqueó durante 30 min a temperatura ambiente con leche de piel que contenía TBST (5 %) y se sondeó durante la noche a 4 °C con anti-ACSS2 (Restore™ PLUS Western Blot Stripping Buffer, 46430, Thermo Scientific). Los resultados cuantitativos se representan en el panel derecho.

Para determinar si el ACSS2 regulado al alza está implicado en la alcaliptosis, utilizamos dos shRNA específicos para generar células PDAC de desactivación de ACSS2. La transferencia de Western confirmó que en las células MiaPaCa2 y PANC1 de ACSS2-knockdown, el nivel de proteína de ACSS2 se inhibió en más del 70% (Fig. 2A). En comparación con el grupo de control, la proliferación celular de las células MiaPaCa2 y PANC1 eliminadas por ACSS2 se inhibió a las 72 h (Fig. 2B), lo que respalda el hallazgo anterior de que ACSS2 es un factor de proliferación. Significativamente, la eliminación de ACSS2 inhibió la inhibición del crecimiento inducida por JTC801 en células MiaPaCa2 y PANC1 a las 24 h (Fig. 2C), destacando un papel diferente de ACSS2 a favor de la muerte celular en respuesta a JTC801. En consonancia con el ensayo de viabilidad celular a corto plazo, el ensayo de clonación celular a largo plazo mostró que, en comparación con el grupo de control, las células eliminadas de ACSS2 tratadas con JTC801 tenían una mayor capacidad de proliferación (Fig. 2D). El uso de tinción con yoduro de propidio (PI) para medir la ruptura de la membrana plasmática confirmó aún más la hipótesis de que ACSS2 es un regulador positivo de la alcaliptosis (Fig. 2E, Fig. S2). En consonancia con estudios previos11,12, las células de ACSS2-knockdown fueron resistentes a la apoptosis inducida por estaurosporina, como lo demuestra un análisis de transferencia Western de la poli(ADP-ribosa) polimerasa-1 (PARP1) escindida y un análisis de citometría de flujo de la actividad de Caspasa-3/7 (Fig. 2F,G). Estos datos establecen un papel diferente de ACSS2 en la promoción de la alcaliptosis inducida por JTC801.

ACSS2 es un regulador positivo de la alcaliptosis. (A) Análisis de transferencia Western de la expresión de la proteína ACSS2 en las líneas celulares de eliminación de ACSS2 indicadas (n = 3 muestras biológicamente independientes). La membrana se recortó y sondeó para los anticuerpos indicados. Los resultados cuantitativos se representan en el panel derecho. (B) Análisis de viabilidad celular en células indicadas a las 24–72 h (n = 3 muestras biológicamente independientes). (C) Análisis de la viabilidad celular en las células indicadas después del tratamiento con JTC801 (1–5 µM) durante 24 h (n = 3 muestras biológicamente independientes). (D) Análisis de la formación de clonación celular en el control indicado o en células PANC1 y MiaPaCa2 tratadas con JTC801. Los resultados cuantitativos se representan en el panel inferior. (E) Análisis de muerte celular por tinción con PI en las células indicadas después del tratamiento con JTC801 (3 µM) durante 24 h (n = 3 muestras biológicamente independientes). Barra = 200 µm. Los resultados cuantitativos se representan en el panel siguiente. (F) Análisis de transferencia Western de la expresión de la proteína ACSS2 y C-PARP en las células indicadas después del tratamiento con estaurosporina (500 nM) o JTC801 (3 µM) durante 24 h (n = 3 muestras biológicamente independientes). La membrana se recortó y sondeó para los anticuerpos indicados. La membrana de PARP fue despojada y reprobada para ACSS2. La membrana se incubó en solución de retransferencia durante 30 min y se bloqueó durante 30 min a temperatura ambiente con leche de piel que contenía TBST (5 %) y se sondeó durante la noche a 4 °C con anti-ACSS2 (Restore™ PLUS Western Blot Stripping Buffer, 46430, Thermo Scientific). (G) Análisis de citometría de flujo de la actividad de Caspasa 3/7 en las células indicadas después del tratamiento con estaurosporina (500 nM) o JTC801 (3 μM) durante 24 h (n = 3 muestras biológicamente independientes).

Dado que el aumento del pH intracelular es un evento metabólico clave que impulsa la alcaliptosis4, utilizamos una sonda fluorescente de pH diseñada para detectar el pH intracelular. Como era de esperar, JTC801 aumentó el pH intracelular en las células MiaPaCa2 y PANC1 (Fig. 3A). Por el contrario, la supresión de la expresión de ACSS2 bloqueó significativamente la regulación positiva del pH intracelular inducida por JTC801 (Fig. 3A). Como control preciso, el pH extracelular medido con una tira de prueba de pH no se vio afectado por JTC801 en el control y las células MiaPaCa2 y PANC1 eliminadas por ACSS2 (Fig. 3B). Estos hallazgos sugieren que ACSS2 promueve la alkaliptosis a través de la regulación positiva del pH intracelular en lugar del pH extracelular.

La acetilación de histonas mediada por ACSS2 inhibe la acidificación del citoplasma en la alcaliptosis. (A, B) Los valores de pH intracelular y extracelular se detectaron en las células MiaPaCa2 y PANC1 indicadas después del tratamiento con JTC801 (3 μM) durante 24 h (n = 3 muestras biológicamente independientes). (C) Análisis ELISA de los niveles de acetil-CoA en las células MiaPaCa2 y PANC1 indicadas después del tratamiento con JTC801 (3 μM) durante 24 h (n = 3 muestras biológicamente independientes). (D) Los valores de pH intracelular se detectaron en las células MiaPaCa2 y PANC1 indicadas después del tratamiento con JTC801 (3 μM) y tricostatina (TSA; 200 nM) durante 24 h (n = 3 muestras biológicamente independientes). (E) Los valores de pH extracelular se detectaron en las células MiaPaCa2 y PANC1 indicadas después del tratamiento con JTC801 (3 μM) y tricostatina (TSA; 200 nM) durante 24 h (n = 3 muestras biológicamente independientes).

Para definir aún más el papel de ACSS2 en la alkaliptosis, analizamos el nivel intracelular de AcCoA. JTC801 indujo la regulación positiva de AcCoA intracelular en las células de control, pero no en las células MiaPaCa2 y PANC1 eliminadas por ACSS2 (Fig. 3C). La tricostatina A (TSA), un amplio inhibidor de la desacetilasa que puede mejorar la acetilación de histonas 17, no logró inducir la regulación positiva del pH intracelular o extracelular en células de tipo salvaje y ACSS2-knockdown (Fig. 3D, E). En general, estos hallazgos indican que ACSS2 media la producción de AcCoA y la regulación positiva del pH intracelular durante la alcaliptosis inducida por JTC801.

Una de las funciones importantes de la producción de AcCoA mediada por ACSS2 es regular la transcripción de genes a través de la acetilación de histonas10. Dado que la activación de NF-κB es un evento de señalización importante que impulsa la alcaliptosis4, a continuación examinamos la relación entre la acetilación de histonas y la vía de NF-κB en células de tipo salvaje y de desactivación de ACSS2 en respuesta a JTC801.

El complejo de quinasas IKK está compuesto por dos quinasas (IKKα e IKKβ) y una subunidad reguladora, NEMO/IKKγ, que son los elementos centrales de la cascada NF-κB18. IKK fosforila la proteína IκBα, lo que conduce a la subsiguiente ubiquitinación de IκBα, que eventualmente es degradada por el proteasoma18. Después de que IκBα se disocia de NF-κB (RelA y p50), el NF-κB activado se transfiere del citoplasma al núcleo, donde comienza a iniciar la transcripción génica18. Nuestros resultados de Western blot mostraron que JTC801 regula al alza la expresión de proteínas de lisina acetilada con histonas (AC-K2-100) (Fig. S3C y Fig. 3D) y los componentes centrales de la vía NF-κB (IKKα, IKKβ y NF- κB) en células MiaPaCa2 (Fig. 4A, B), y el ensayo de viabilidad celular mostró que el acetato aumentó la sensibilidad de las células MiaPaCa2 y PANC1 a JTC801 (Fig. S4). Por el contrario, la eliminación de ACSS2 revirtió este proceso y se asoció con una reducción en los eventos de fosforilación de NF-κB y un aumento en la expresión de CA9 (Fig. 4A, B). Nuestros experimentos de coIP demuestran el nivel de acetilación de NF-κB en líneas celulares con eliminación de ACSS2 (Fig. 4C). También detectamos el nivel de acetilación y la expresión de CA9 después de la eliminación de ACSS2 mediante transferencia Western (Fig. S3A y S3B). Estos hallazgos indican que ACSS2 mantiene la regulación negativa de CA9 mediada por NF-κB durante la alcaliptosis inducida por JTC801. Como control positivo, CA9 se reguló durante la hipoxia inducida por CoCl2 (Fig. S5).

La acetilación de histonas mediada por ACSS2 promueve la alcaliptosis. (A,B) Análisis de transferencia Western de la expresión de la proteína indicada en líneas celulares de control o silenciadas ACSS2 después del tratamiento con JTC801 (3 μM) durante 24 h (n = 3 muestras biológicamente independientes). Los resultados de Western blot representativos se muestran en el panel izquierdo. La membrana se recortó y sondeó para los anticuerpos indicados. La membrana de p-IKKα/β se desnudó y se reprobó para IKKα e IKKβ. La membrana se incubó en solución de retransferencia durante 30 min y se bloqueó durante 30 min a temperatura ambiente con leche de piel que contenía TBST (5 %) y se sondeó durante la noche a 4 °C con anti-IKKα. Repita los pasos anteriores para reprobar la membrana con el anticuerpo anti-IKKβ. La membrana de p-NFκB se desnudó y se reprobó para ACSS2. La membrana de p-IκBα se separó y se reprobó para IκBα y GAPDH. La expresión de la proteína de CA9 se midió en las líneas celulares indicadas después del tratamiento con JTC801 (3 μM) durante 24 h bajo 5 % de CO2 y normoxia. Los resultados cuantitativos se representan en el panel derecho. (C) Control o eliminación de ACSS2 en células MIAPaCa2 y PANC1. Los lisados ​​​​celulares se extrajeron para coIP, los inmunoprecipitados se analizaron utilizando los anticuerpos indicados y la transferencia Western representativa que se muestra en el panel izquierdo. La membrana de Ac-lys se desnudó y se reprobó para NFκB. (D) Las líneas celulares de control o ACSS2 knockdown se trataron con JTC801 (1–5 μM) en ausencia o presencia de tricostatina (TSA, 200 nM) durante 24 h y luego se analizó la viabilidad celular (n = 3 muestras biológicamente independientes) . (E) Diagrama esquemático del papel de ACSS2 en la alcaliptosis inducida por JTC801.

A continuación, examinamos si la TSA puede revertir el efecto inhibidor de la alcaliptosis en las células MiaPaCa2 eliminadas por ACSS2. Un ensayo de viabilidad celular mostró que TSA restauró la sensibilidad de las células MiaPaCa2 eliminadas por ACSS2 a JTC801 (Fig. 4D). Por el contrario, la sinergia de TSA y JTC801 en células de tipo salvaje fue débil (Fig. 4D).

PDAC es actualmente el cáncer más mortal del sistema digestivo, con una tasa de supervivencia general a 5 años de alrededor del 10%. En comparación con la quimioterapia actual que induce la apoptosis, los RCD no apoptóticos (incluida la alcaliptosis) brindan nuevas oportunidades para el tratamiento de PDAC19. En este estudio, demostramos que ACSS2 es un nuevo regulador de la alcaliptosis al activar la vía NF-κB en células PDAC humanas (Fig. 4E). Si bien ACSS2 puede mediar la resistencia a la apoptosis, se regula positivamente durante la alcaliptosis inducida por JTC801 en células PDAC. Estos hallazgos respaldan que ACSS2 desempeña un papel dual en la muerte celular, según el estímulo. La inducción de alkaliptosis puede ser un método valioso para el tratamiento de PDAC con alta expresión de ACSS2.

En comparación con ACSS1 y ACSS3 específicos de tejido, la expresión de ACSS2 está muy extendida en diferentes tejidos20. Los estudios preclínicos han demostrado que ACSS2 puede usar acetato para mediar en la acetilación de histonas, que desempeña un papel clave en la regulación de la expresión génica, el crecimiento celular y el desarrollo del cáncer9,10. En el estudio actual, demostramos que la alcaliptosis inducida por JTC801 requiere esta vía de acetilación de histonas dependiente de ACSS2. Aunque los cambios genéticos globales de la alcaliptosis inducida por JTC801 aún deben estudiarse en el futuro, descubrimos que la expresión y activación de la vía NF-κB se ven afectadas en las células PDAC de ACSS2-knockdown. Al igual que ACSS2, NF-κB suele ser un factor favorable a la supervivencia que inhibe la apoptosis. Sin embargo, la alcaliptosis depende en parte de la activación de NF-κB para inhibir la expresión de CA9, lo que lleva a un aumento del pH4 intracelular. El aumento del pH intracelular puede acelerar aún más la acetilación general de histonas, que depende de los transportadores de ácido monocarboxílico21. En general, estos hallazgos establecen una estrategia potencial para usar señales o vías favorables a la supervivencia para desencadenar la muerte celular en las células PDAC.

Además de mediar en la regulación epigenética de la transcripción de genes por acetilación de histonas, otra función importante de la familia ACSS, incluida ACSS2, en la biología tumoral es mediar en la síntesis de ácidos grasos para el crecimiento tumoral6. La síntesis de ácidos grasos es la producción de ácidos grasos a partir de AcCoA y NADPH por FASN. Sin embargo, la síntesis excesiva de ácidos grasos también juega un papel en la mediación de la muerte celular al activar la ferroptosis dependiente de la peroxidación lipídica. En particular, la ruta de biosíntesis de ácidos grasos poliinsaturados juega un papel esencial en la ferroptosis22. Sin embargo, los primeros estudios han demostrado que los inhibidores de la ferroptosis, como la ferrostatina-1, no pueden inhibir la muerte celular inducida por JTC8014. Por lo tanto, aunque diferentes RCD pueden compartir algunas señales, sus efectores y mecanismos de retroalimentación son diferentes.

La alcaliptosis es generalmente un tipo de necrosis regulada con ruptura de la membrana plasmática y liberación de patrones moleculares asociados al daño (DAMP). La caja de grupo de alta movilidad 1 (HMGB1) es un DAMP nuclear representativo en una variedad de RCD, que puede desencadenar varias respuestas inmunitarias. Por ejemplo, las células cancerosas pueden liberar HMGB1 en respuesta a la quimioterapia o la radioterapia para activar las células presentadoras de antígeno circundantes y lograr la inmunidad antitumoral23. Recientemente observamos que HMGB1 es un mediador de la respuesta inflamatoria provocada por la lesión alcaliptótica24. Además de la liberación pasiva, la secreción activa de HMGB1 en el espacio extracelular requiere la acetilación de HMGB125. Es importante examinar más a fondo si la acetilación y la liberación de HMGB1 dependen de la regulación positiva de ACCS2 en la alcaliptosis, lo que puede favorecer el desarrollo de inmunoterapias para PDAC.

En resumen, demostramos que ACCS2 es un nuevo regulador de la alcaliptosis al activar la acetilación de histonas. Estos hallazgos subrayan la importancia potencial de ACCS2 como biomarcador y contribuyente al tratamiento mediado por alkaliptosis5.

Los datos de micromatrices se depositan en GEO con el acceso GSE206290 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE206290 Introduzca el token ynipqmqkvrmlrux en el cuadro.

Tang, D. et al. La maquinaria molecular de la muerte celular regulada. Resolución celular 29, 347–364 (2019).

Artículo CAS Google Académico

Hanahan, D. & Weinberg, RA Distintivos del cáncer: la próxima generación. Celda 144, 646–674 (2011).

Artículo CAS Google Académico

Ye, J. et al. Muerte celular no apoptótica en células tumorales malignas y compuestos naturales. Cáncer Lett. 420, 210–227 (2018).

Artículo CAS Google Académico

Canción, X. et al. JTC801 induce la muerte dependiente del pH específicamente en células cancerosas y ralentiza el crecimiento de tumores en ratones. Gastroenterología 154, 1480–1493 (2018).

Artículo CAS Google Académico

Chen, F. et al. ATP6V0D1 promueve la alcaliptosis al bloquear la homeostasis del pH lisosomal mediada por STAT3. Informe celular 42, 111911 (2022).

Artículo Google Académico

Shi, L. & Tu, BP Acetil-CoA y la regulación del metabolismo: Mecanismos y consecuencias. actual Opinión Biol celular. 33, 125–131 (2015).

Artículo CAS Google Académico

Galdieri, L. & Vancura, A. Acetil-CoA carboxilasa regula la acetilación global de histonas. J. Biol. química 287, 23865–23876 (2012).

Artículo CAS Google Académico

Yoshimura, Y., Araki, A., Maruta, H., Takahashi, Y. & Yamashita, H. Clonación molecular de acss3 de rata y caracterización de la propionil-CoA sintetasa de mamíferos en la matriz mitocondrial del hígado. J. Bioquímica. 161, 279–289 (2017).

CAS Google Académico

Bulusu, V. et al. La recaptura de acetato por la acetil-CoA sintetasa 2 nuclear previene la pérdida de acetilación de histonas durante la limitación de oxígeno y suero. Representante celular 18, 647–658 (2017).

Artículo CAS Google Académico

Li, X. et al. ACSS2 con translocación de núcleo promueve la transcripción de genes para la biogénesis lisosomal y la autofagia. mol. Celda 66(684–97), e9 (2017).

Google Académico

Yao, L., Guo, X. & Gui, Y. La acetil-CoA sintetasa 2 promueve la migración celular y la invasión del carcinoma de células renales mediante la regulación positiva de la expresión de la proteína de membrana 1 asociada a los lisosomas. Fisiol Celular. Bioquímica 45, 984–992 (2018).

Artículo CAS Google Académico

Zaidi, N., Royaux, I., Swinnen, JV y Smans, K. La caída de la citrato liasa de ATP induce la detención del crecimiento y la apoptosis a través de diferentes mecanismos dependientes de las células y el medio ambiente. mol. Cáncer Ther. 11, 1925-1935 (2012).

Artículo CAS Google Académico

Canción, X. et al. PDK4 dicta la resistencia metabólica a la ferroptosis al suprimir la oxidación del piruvato y la síntesis de ácidos grasos. Informe celular 34, 108767 (2021).

Artículo CAS Google Académico

Sun, J. & Wu, J. Perfiles de expresión de ARN largos no codificantes en testículos de ratones recién nacidos y adultos. Resumen de datos 4, 322–327 (2015).

Artículo Google Académico

Liu, J. et al. NUPR1 es un represor crítico de la ferroptosis. Nat. común 12, 647 (2021).

Artículo ADS CAS Google Académico

Rosenzweig, A., Blenis, J. & Gomes, AP Más allá del efecto Warburg: ¿Cómo regulan las células cancerosas el metabolismo de un carbono?. Frente. Desarrollo celular Biol. 6, 90 (2018).

Artículo Google Académico

Vigushin, DM et al. La tricostatina A es un inhibidor de la histona desacetilasa con una potente actividad antitumoral contra el cáncer de mama in vivo. clin. Cáncer Res. 7, 971–976 (2001).

CAS Google Académico

Taniguchi, K. & Karin, M. NF-kappaB, inflamación, inmunidad y cáncer: mayoría de edad. Nat. Rev. Inmunol. 18, 309–324 (2018).

Artículo CAS Google Académico

Chen, X., Zeh, HJ, Kang, R., Kroemer, G. y Tang, D. Muerte celular en el cáncer de páncreas: de la patogénesis a la terapia. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 18, 804–823 (2021).

Artículo Google Académico

Huang, Z. et al. ACSS2 promueve el almacenamiento y la utilización de grasa sistémica a través de la regulación selectiva de genes implicados en el metabolismo de los lípidos. proc. nacional Academia ciencia EE. UU. 115, E9499–E9506 (2018).

Artículo ADS CAS Google Académico

Payen, VL, Mina, E., Van Hee, VF, Porporato, PE y Sonveaux, P. Transportadores de monocarboxilato en el cáncer. mol. metab. 33, 48–66 (2020).

Artículo CAS Google Académico

Stockwell, BR et al. Ferroptosis: un nexo de muerte celular regulado que vincula el metabolismo, la biología redox y la enfermedad. Celda 171, 273–285 (2017).

Artículo CAS Google Académico

Galluzzi, L. et al. Directrices de consenso para la definición, detección e interpretación de la muerte celular inmunogénica. J. Immunother. Cáncer 8, e000327 (2020).

Artículo Google Académico

Colmillo, X. et al. La vía HMGB1-AGER-STING1 media la respuesta inflamatoria estéril a la alcaliptosis. Bioquímica Biografía. Res. común 560, 165–171 (2021).

Artículo CAS Google Académico

Bonaldi, T. et al. Las células monocíticas hiperacetilan la proteína cromatina HMGB1 para redirigirla hacia la secreción. EMBO J. 22, 5551–5560 (2003).

Artículo CAS Google Académico

Descargar referencias

Agradecemos a Dave Primm (Departamento de Cirugía, Centro Médico Southwestern de la Universidad de Texas) por su lectura crítica del manuscrito.

El Laboratorio DAMP, Tercer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Guangzhou, Guangzhou, 510120, Guangdong, China

Dongwen Que, Feimei Kuang y Jiao Liu

Departamento de Cirugía, UT Southwestern Medical Center, Dallas, TX, 75390, EE. UU.

Rui Kang y Daolin Tang

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

DT y JL concibieron y planificaron los experimentos. DQ, FK y JL llevaron a cabo las simulaciones y la preparación de muestras y analizaron los datos. DQ y DT escribieron el artículo. RK ayudó en la interpretación de datos y editó el manuscrito. Todos los autores brindaron comentarios críticos y ayudaron a dar forma a la investigación, el análisis y el manuscrito.

Correspondencia a Daolin Tang o Jiao Liu.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Que, D., Kuang, F., Kang, R. et al. La activación de NF-κB mediada por ACSS2 promueve la alcaliptosis en células de cáncer de páncreas humano. Informe científico 13, 1483 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-28261-4

Descargar cita

Recibido: 17 mayo 2022

Aceptado: 16 enero 2023

Publicado: 27 enero 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-28261-4

Cualquier persona con la que compartas el siguiente enlace podrá leer este contenido:

Lo sentimos, un enlace para compartir no está disponible actualmente para este artículo.

Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenido Springer Nature SharedIt

Al enviar un comentario, acepta cumplir con nuestros Términos y Pautas de la comunidad. Si encuentra algo abusivo o que no cumple con nuestros términos o pautas, márquelo como inapropiado.