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Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 16579 (2022) Citar este artículo

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La rata algodonera (Sigmodon) es el modelo de animal pequeño preclínico estándar de oro para patógenos virales respiratorios, especialmente para el virus respiratorio sincitial (RSV). Sin embargo, sin un genoma de referencia o un transcriptoma publicado, los estudios que requieren un análisis de la expresión génica en ratas algodoneras son muy limitados. Los objetivos de este estudio fueron generar un transcriptoma integral a partir de múltiples tejidos de dos especies de ratas algodoneras que se usan comúnmente como modelos animales (Sigmodon fulviventer y Sigmodon hispidus), y comparar y contrastar los cambios en la expresión génica y las respuestas inmunitarias a la infección por RSV entre las dos especies. Los transcriptomas se ensamblaron a partir de pulmón, bazo, riñón, corazón e intestinos para cada especie con un contig N50 > 1600. La anotación de contigs generó casi 120 000 anotaciones de genes para cada especie. A continuación, se utilizaron los transcriptomas de S. fulviventer y S. hispidus para evaluar la respuesta inmunitaria a la infección por RSV. Identificamos 238 genes únicos que se expresan de manera significativamente diferencial, incluidos varios genes implicados en la infección por RSV (p. ej., Mx2, I27L2, LY6E, Viperin, Keratin 6A, ISG15, CXCL10, CXCL11, IRF9), así como genes novedosos que no se han descrito previamente. en investigación RSV (LG3BP, SYWC, ABEC1, IIGP1, CREB1). Este estudio presenta dos referencias completas de transcriptoma como recursos para futuros estudios de análisis de expresión génica en el modelo de rata de algodón, así como proporciona secuencias de genes para la caracterización mecánica de vías moleculares. En general, nuestros resultados brindan información generalizable sobre el efecto de la genética del huésped en las interacciones entre el virus y el huésped, así como también identifican nuevos objetivos terapéuticos del huésped para el tratamiento y la prevención del RSV.

El virus sincitial respiratorio (VSR) es la principal causa de infección del tracto respiratorio inferior (IVRI) en niños menores de dos años, así como en personas inmunocomprometidas y ancianos, lo que resulta en 33 millones de IVRI, 3,2 millones de ingresos hospitalarios y casi 120.000 muertes en todo el mundo cada año1. Actualmente no existe una vacuna RSV aprobada y solo un anticuerpo monoclonal preventivo (Palivizumab), con uso limitado a niños de alto riesgo debido a los costos2,3. Dado que el 93 % de los casos de RSV LRTI y el 99 % de la mortalidad por RSV ocurren en países en desarrollo, la necesidad de una vacuna efectiva y preventivos de bajo costo es fundamental1. El fracaso de la vacuna RSV inactivada con formalina en la década de 1960, que indujo un aumento de la enfermedad en los vacunados al encontrarse con el virus, obstaculizó el desarrollo de nuevas vacunas RSV durante décadas4–6. Sin embargo, recientemente ha habido un esfuerzo renovado para desarrollar productos preventivos contra el VSR, con 14 vacunas candidatas y estrategias antivirales alternativas contra el VRS (anticuerpos recombinantes7, nanocuerpos8, inhibidores de moléculas pequeñas y análogos9) que se encuentran en diversas etapas de desarrollo10. Esto destaca la necesidad crítica de un modelo preclínico apropiado para el desarrollo de vacunas y fármacos contra el RSV.

La rata algodonera (género Sigmodon) se considera el modelo animal "estándar de oro" para la infección por RSV en comparación con los ratones y otros animales porque es 100 veces más permisiva que la mayoría de los ratones de laboratorio para la infección por RSV y el RSV infecta tanto su parte superior como la inferior. vías respiratorias similares a las de los humanos11–13. Las ratas algodoneras también predijeron con precisión la eficacia de las dos terapias contra el RSV aprobadas por la FDA (RespiGam®, Palivizumab®)14–17. Además del RSV, las ratas algodoneras se han utilizado para estudiar otros virus respiratorios humanos importantes, es decir, el virus de la influenza A18,19, el virus de la parainfluenza20,21, el sarampión22, el metapneumovirus humano23, el enterovirus D6824 y el rinovirus humano25, debido a la amplia susceptibilidad y características comparables de enfermedades humanas26. Desafortunadamente, los estudios que comparan los cambios transcriptómicos en ratas de algodón han sido limitados debido a la falta de un genoma de referencia disponible públicamente para cualquier especie de rata de algodón. Previamente, publicamos un transcriptoma de tejido pulmonar inducido por RSV en S. hispidus27. Sin embargo, en ese estudio solo habíamos analizado la expresión en un tipo de tejido y se limitó a una sola especie de rata algodonera (S. hispidus). Como muestran estudios previos, tanto los específicos de S. fulviventer como los de S. hispidus difieren en la gravedad de la enfermedad para los patógenos virales (es decir, el virus de la parainfluenza28, el VIH29) y la estructura de la comunidad del microbioma30. Los objetivos principales de este estudio fueron desarrollar transcriptomas integrales para ambas especies y comparar y contrastar los cambios en la expresión génica tras la infección por RSV.

Con este fin, secuenciamos el ARN total de múltiples tejidos (pulmón, bazo, corazón, riñón, colon) de animales sanos y generamos un transcriptoma completo utilizando ensamblaje de novo con anotación funcional para dos especies de ratas algodoneras (S. fulviventer y S. híspido). Luego, infectamos cada especie de rata algodonera con la cepa RSV A/Long junto con los controles no infectados y usamos nuestras referencias transcriptómicas para determinar los genes expresados ​​diferencialmente después de la infección por RSV.

El ARN total se extrajo de secciones de bazo, corazón, riñón, pulmón y colon recolectadas de S. fulviventer y S. hispidus sanos de 4 a 6 semanas de edad para un ensamblaje completo del transcriptoma (tabla complementaria 1). Las bibliotecas de RNA-seq se secuenciaron a una profundidad de 50 millones de extremos emparejados 2 × 150 por muestra. Después de secuenciar el control de calidad de lectura, agrupamos los datos de todos los tejidos sanos (n = 2 por especie, pulmón n = 4 por especie) para generar 456 millones de lecturas de extremos emparejados para S. fulviventer (contenido de GC 54,9 %) y 465 millones de lecturas de extremos emparejados. para S. hispidus (contenido de GC 53,1%). El transcriptoma para cada especie se generó utilizando un ensamblaje de novo, que luego se utilizó como base de datos de referencia para evaluar los cambios transcriptómicos inducidos por RSV en los pulmones de los animales infectados en comparación con los controles no infectados.

Para cada especie, se combinaron lecturas secuenciadas de los 5 tipos de tejido. Trinity31 se utilizó para el ensamblaje de novo de contigs (también denominados "transcripciones") después de la normalización in silico para lograr una cobertura promedio de 50x. El ensamblador generó más de 1,3 millones de contigs por especie, que se filtraron aún más en función de la longitud32 y la redundancia33,34 (tabla complementaria 1). Las siguientes estadísticas de ensamblaje se muestran en la Tabla 1. A cada transcrito se le asignó un identificador único que designaba cada 'gen' (S. fulviventer = 587 619, S. hispidus = 559 830) y sus 'isoformas' empalmadas alternativamente (S. fulviventer = 620 569, S. hispidus = 592.099). Los transcritos ensamblados de ambas especies tenían un contenido de GC del 43 % y contig N50 > 1600 (que excede el N50 de otros ensamblajes de transcriptomas publicados35,36,37). El Ex90N50, que es el N50 pero limitado al 90 % superior del total de transcripciones normalizadas, fue 2503 (S. fulviventer, #transcripts = 108 995) y 2162 (S. hispidus, #transcripts = 240 587) (Tabla 1).

El número de transcritos y sus niveles de expresión varió entre el tipo de tejido, y varios transcritos fueron específicos de tejido, siendo el pulmón el que tuvo el mayor número de transcritos únicos (S. fulviventer = 47 448, S. hispidus = 38 270) (Fig. 1A, B ). Se encontraron otras transcripciones en los 5 tejidos (S. fulviventer = 216 307, S. hispidus = 225 833) o una combinación de dos o más tipos de tejido (Fig. 1A, B). Muchas transcripciones se expresaron diferencialmente entre tejidos (S. fulviventer = 49,215, S. hispidus = 55,415) según lo determinado por DESeq2 y visualizado por agrupación jerárquica de mapas de calor38 (Fig. 1C, D). El análisis de componentes principales muestra una diferencia significativa en los patrones de expresión génica entre especies y diferentes muestras de tejido, indicado por una fuerte agrupación en función de la especie y el tipo de tejido (Fig. 1E). Después del ensamblaje, las transcripciones se anotaron utilizando la base de datos de secuencias de proteínas (SwissProt) para buscar homología con otras especies. Para ambas especies, las transcripciones compartieron la homología más alta con Mus musculus (54 %), Homo sapiens (17 %) y Rattus rattus (13 %) (Fig. 1F).

Ensamblaje del transcriptoma de Sigmodon usando Trinity. (A,B) Gráfica UpSet de transcripciones superpuestas y específicas de tejido expresadas en el bazo (azul), corazón (verde), riñón (rojo), colon (naranja) y pulmón (azul) de ambos (A) S. fulviventer (n = 2) y (B) S. hispidus (n = 2). Las barras de secuencias superpuestas se muestran en negro, mientras que las barras de secuencias exclusivas de órganos individuales se muestran en los colores correspondientes. El número de transcripciones superpuestas se muestra encima de cada barra, con una comparación de órganos individuales en el eje y. El número de genes únicos por tejido está representado por el gráfico de barras horizontal. (C,D) Agrupación jerárquica y mapa de calor por puntuación Z de todas las transcripciones expresadas diferencialmente (Q < 0.001, L2fc > 2, distancia euclidiana) dentro de muestras de tejido individuales de (C) S. fulviventer y (D) S. hispidus. (E) Análisis de componentes principales (PCA) de transcripciones expresadas dentro de tejido sano de ambas especies. (F) Fuente taxonómica de anotaciones de genes determinada por NCBI BlastX. Los datos representan anotaciones del transcriptoma de S. fulviventer; S. hispidus no se muestra pero varía en ~ 1% en todas las categorías excepto en "otros".

Para evaluar la calidad de nuestro ensamblaje (Tabla 1), mapeamos el ensamblaje completo de nuevo a las lecturas recortadas por calidad utilizando Bowtie239 para encontrar que el 81,9 % y el 87,9 % de las lecturas se utilizaron durante el ensamblaje del transcriptoma de S. fulviventer y S. hispidus, respectivamente. , para los cuales > 70% es indicativo de buena calidad. También evaluamos la integridad del transcriptoma mediante la búsqueda de grupos BUSCO40 conservados evolutivamente del conjunto de datos del linaje vertebrata_odb10 (total n = 3354) dentro de nuestro conjunto de datos. El ensamblaje de S. fulviventer tenía un 92,7 % de BUSCO completos (Completo: 3109 [Completo y único: 785, Completo y duplicado: 2324], Fragmentado: 154, Faltante: 91), y S. hispidus tenía un 90,2 % de BUSCO completos (Completo: 3025 [Completo y único: 2599 , Completo y duplicado: 426], Fragmentado: 194, Faltante: 135). Todas las estadísticas de calidad de ensamblaje también se muestran en la Tabla 1. Los ensamblajes de transcriptoma de referencia final para cada especie están disponibles como archivo complementario 1 (S. hispidus) y archivo complementario 2 (S. fulviventer).

Las transcripciones se anotaron funcionalmente utilizando la canalización Trinotate (https://trinotate.github.io/). Las referencias del transcriptoma se generaron para cada especie de forma independiente. Primero, las transcripciones de ratas de algodón se alinearon con una base de datos de anotaciones de proteínas no redundantes (UniProt41), que contiene secuencias de 14 132 taxones diferentes (http://web.expasy.org/docs/relnotes/relstat.html), según la homología de secuencia. a través de BLASTx42 (valor de corte e < 1e-05). Anotamos 118 060 transcripciones que comprenden 18 726 genes únicos para S. fulviventer y 117 153 transcripciones que comprenden 18 380 genes únicos para S. hispidus de las ~ 600 000 transcripciones ensambladas para cada especie (Tabla 1). A continuación, se identificaron las regiones de codificación en función de los marcos de lectura abiertos (S. fulviventer = 118.159, S. hispidus = 113.999). Las transcripciones de codificación de proteínas se anotaron utilizando BLASTp42 (valor e de corte < 1e05) contra la base de datos UniProt41 para identificar > 30 000 proteínas anotadas por especie (~ 17 000 proteínas después de filtrar anotaciones duplicadas). Las proteínas se anotaron aún más en función de los dominios de proteínas (> 5000), las hélices transmembrana (> 18 000) y las proteínas de señalización (> 7700). Todas las estadísticas de anotación se pueden encontrar en la Tabla 1, y el informe de anotación completo se puede ver en el archivo complementario 3.

Además de las anotaciones de nombres de genes, la alineación de BLAST con UniProt también asignó varios términos funcionales para describir genes, incluida la Enciclopedia de genes y genomas de Kioto (KEGG) Pathways43, Gene Ontology (GO)44 y EggNOG orthology45. Los términos de Gene Ontology (GO) describen las propiedades funcionales de los genes y su relación entre sí. Se asignaron uno o más términos GO al 98,35 % de transcripciones anotadas de S. fulviventer (n = 116 115) y al 98,45 % de transcripciones anotadas de S. hispidus (n = 115 332). Los términos GO se agruparon en 3 categorías: procesos biológicos, componentes celulares y función molecular (Fig. 2). Los genes de S. fulviventer y S. hispidus tenían una proporción similar de GO asociados. Los principales GO de procesos biológicos incluyeron "procesos metabólicos de compuestos de nitrógeno celular" (~ 25 %), "procesos metabólicos de ADN" (~ 17 %), "transporte" (~ 16 %) y "desarrollo de estructuras anatómicas" (~ 15 %). (Fig. 2A). Los GO del componente celular consistían principalmente en "orgánulos" (~ 38%), "citoplasma" (~ 24%), "citosol" (~ 18%) y "núcleo" (16%) (Fig. 2B). Los GO de funciones moleculares más comunes incluyen "nucleotidiltransferasa" (~ 15 %), "nucleasa" (~ 15 %), "unión de enzimas" (~ 9 %) y "unión de ácidos nucleicos" (ARN = 8 %, ADN = 8 %) (Fig. 2C).

Anotación del transcriptoma de Sigmodon. (A) Procesos biológicos, (B) componentes celulares y (C) función molecular Términos de la Ontología génica SwissProt (GO) en el eje x (GO totales dentro de las categorías respectivas, incluidas las superposiciones representadas en las leyendas de las figuras) con el número de GO (porcentaje de total ~ 107 k transcripciones anotadas) en el eje y; GO asignado contra la base de datos TrEMBL/SwissProt usando Trinotate v.3.2.2. (D) 25 principales KEGG y (E) vías específicas del sistema inmunitario en el eje x con el número total de genes que codifican proteínas en el eje y; rutas asignadas usando CDS determinado por TransDecoder seguido por GhostKOALA (https://www.kegg.jp/ghostkoala/).

La mayoría de las vías de KEGG identificadas pertenecían al metabolismo y la señalización, específicamente la biosíntesis de metabolitos secundarios, las interacciones ligando/citocina/receptor de metal y una variedad de vías de señalización (Fig. 2D, consulte también la Figura S1A para la distribución de "señalización y transporte de membrana" KEGG caminos). Examinamos las vías KEGG inmunoespecíficas para mostrar la gran cantidad de genes relevantes identificados en el transcriptoma de novo, incluida la señalización de quimiocinas, la señalización de receptores celulares innatos y adaptativos, las cascadas del complemento y la diferenciación de linfocitos (Fig. 2E). KEGG también proporciona mapeo de genes contra muchas vías de infección, incluidos agentes infecciosos modelados con éxito en ratas de algodón, es decir, influenza18, VIH-129 y sarampión22 (Figura S1B). Mapeamos las anotaciones de genes tanto de S. fulviventer como de S. hispidus a los genes del huésped asociados con la vía KEGG de la infección por influenza, que abarcaba el 94,3% de los genes requeridos durante la infección por influenza (Fig. 3). Todas las demás rutas se pueden reconstruir y visualizar utilizando la herramienta de reconstrucción de KEGG (https://www.kegg.jp/kegg/mapper/reconstruct.html) utilizando los datos incluidos en el archivo complementario 4.

La ruta de la enfermedad de influenza (adaptado de la Enciclopedia de genes y genomas de Kioto [KEGG]). 99 de los 105 genes esenciales de la patogénesis de la influenza se ensamblaron y anotaron con éxito en nuestro transcriptoma de novo de S. fulviventer y S. hispidus. Creado con BioRender.

Infectamos S. fulviventer y S. hispidus por vía intranasal con 105 UFP de RSV A/Long o PBS (como control de infección simulado) y recolectamos los pulmones después de 5 días después de la infección para su análisis. La infección se confirmó mediante qRT-PCR dirigida al ARNm de RSV G y F, donde se encontró una copia de ARN significativamente mayor en el animal infectado, mientras que los controles no infectados no tenían amplificación de ARN viral (Fig. 4A). No hubo diferencias significativas en los niveles de ARN viral entre S. fulviventer y S. hispidus después de 5 días de infección (p = 0,3491, prueba de comparaciones múltiples de Tukey). El tejido pulmonar se evaluó para histopatología (Fig. 4B) y se calificó a ciegas para 4 parámetros inflamatorios como se describe en los métodos: peribronquiolitis, perivasculitis, neumonía intersticial y alveolitis (Fig. 4C). Cada animal infectado tuvo una puntuación de patología acumulada significativamente mayor en comparación con los controles no infectados, lo que indica una infección exitosa (Sf p = 0.0020, Sh p = < 0.0001, prueba de comparaciones múltiples de Tukey) (Fig. 4C). Luego se secuenció el ARN como se describe, y las lecturas se alinearon con el transcriptoma de referencia previamente anotado para cada especie. Después de la normalización de la expresión, el análisis de la expresión génica mostró que la infección por RSV alteraba significativamente los patrones de expresión. La infección por RSV en los pulmones de S. hispidus resultó en mayores alteraciones en la expresión génica que la de S. fulviventer (Figura 2 complementaria).

Cambios inducidos por RSV en el entorno pulmonar. (A) Títulos virales (proteínas RSV G y F) en pulmones no infectados e infectados determinados por qRT-PCR normalizados a β-actina; cambio de pliegue (calculado por 2−ΔΔCT) en el eje y. (B) Imagen histopatológica y (C) puntuación de patología generada a ciegas para tejido pulmonar sano (n = 4/especies) e infectado por RSV (n = 5/especies) de S. fulviventer y S. hispidus. (D,E) El análisis DESeq2 de genes ensamblados de tejidos pulmonares (el mismo tejido fotografiado en las Figuras AB) reveló varios genes que se expresan de forma diferencial (DE) entre tejidos sanos e infectados (p < 0,05, q < 0,05, l2fc >|1,0| ) de S. fulviventer (azul) y S. hispidus (rojo), de los cuales varios genes se anotaron con éxito usando Trinotate (como se indica en los recuadros). *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p ≤ 0,0001.

Los análisis de expresión diferencial de genes (RSV A/Long vs. Controles con infección simulada) identificaron varios genes que estaban regulados diferencialmente hacia arriba y hacia abajo en los pulmones infectados, incluidos genes únicos y comunes para cada especie de rata algodonera (Fig. 4D). La infección por RSV en S. fulviventer dio como resultado 325 genes regulados al alza únicos (98 anotados) y 140 genes regulados a la baja únicos (20 anotados). La infección por RSV en S. hispidus resultó en 750 genes regulados al alza (44 anotados) y 245 genes regulados a la baja (8 anotados) (Fig. 4D, E, datos completos en el archivo complementario 5). Al combinar los datos de infección de ambas especies, encontramos que 276 genes (12 anotados) estaban regulados al alza en ambas especies, mientras que 9 genes (0 anotados) estaban regulados a la baja en ambas especies. Solo se seleccionaron los genes anotados para cada especie para su posterior análisis. En la Tabla 2 (S. fulviventer) y la Tabla 3 (S. hispidus) se enumeran veinte de los genes anotados expresados ​​diferencialmente más importantes (seleccionados según la función y la ontología génica).

En S. fulviventer, varios genes se redujeron tras la infección relacionados con la estructura de inmunoglobulina (HVM44), factores de transcripción (CREB1, CRY1), integridad de la estructura epitelial (K2C8), formación y mantenimiento de uniones estrechas (OCLD), regulación del tráfico de membrana (CPNE3) , degradación de ARN dirigida (MOV10) y remodelación y homeostasis de tejidos (MFGM). GLYC, que es la proteína G del RSV, se marcó como regulada al alza en los pulmones del RSV debido a la ausencia de lecturas en el grupo no infectado (indicado por DESeq2 basemean = 0). Los genes del huésped regulados al alza estaban relacionados con el sistema del complemento (CFAB), la señalización del receptor inmunitario (UN93B), el tráfico de vesículas (EXOC5), la actividad antiviral inducida por interferón (MX2, CXCL10, I27L2, OAS1A, IIGP1, ISG15), el metabolismo de las prostaglandinas (PGDH) y transporte de electrones (COX1). Estos genes de S. fulviventer expresados ​​diferencialmente después de la infección por RSV se enumeran en la Tabla 2.

En S. hispidus, solo se reguló a la baja 1 gen anotado: LMTD1, que está involucrado en la proliferación celular. Otros genes regulados a la baja tenían anotaciones que indicaban la inclusión de péptidos de señalización (a través de SignalP) y regiones transmembrana (a través de TmHMM) pero con función desconocida (Archivo complementario 5). Varios genes inmunes regulados al alza en S. hispidus también se regularon al alza en S. fulviventer (I27L2, CXCL10, MX2). La mayoría de los genes regulados al alza estaban relacionados con la estimulación de la actividad antiviral por parte de las citoquinas (OAS3, CXCL11, IRF9, IFIT1, NLRC5), degradación proteasómica (PSB9), reorganización del citoesqueleto en respuesta al estrés (SYWC, K2C6A), activación de células T (HSH2D, LY6E), regulación postranscripcional (ABEC1), degradación de proteínas virales (RSAD2/Viperin), vía del complemento (CO4A, C4BPA), metabolismo químico (GBP4) y transducción de señales relacionadas con la defensa celular (LG3BP). Estos genes de S. hispidus expresados ​​diferencialmente después de la infección por RSV se presentan en la Tabla 3.

De los genes expresados ​​diferencialmente (DEG) después de la infección por RSV, se encontró que 12 DEG estaban regulados hacia arriba o hacia abajo tanto en S. fulviventer como en S. hispidus. Las quimiocinas CXCL10, MX2 e I27L2 se encontraban entre los 10 principales genes regulados al alza en ambas especies. Otros DEG dentro de nuestro umbral de importancia incluyen GBP2, GBP4, IRF9, NLRC5, OAS3, PAR14, RN213, SYWC e IIGP1. Todos los DE se pueden encontrar en el archivo complementario 5.

Además, se determinaron los términos de Gene Ontology (GO) expresados ​​diferencialmente utilizando el paquete GoSeq R46. Los principales GO enriquecidos en los pulmones infectados de S. fulviventer (Fig. 5A) y S. hispidus (Fig. 5B) fueron "procesos biológicos" como la respuesta a la citoquina y el interferón-beta, el proceso del sistema inmunitario, la vía de señalización del receptor de la superficie celular , y proceso viral; "funciones moleculares" tales como unión de iones, actividad catalítica, actividad hidrolasa y "componentes celulares" tales como orgánulos y núcleos delimitados por membranas intracelulares. Otros GO enriquecidos en los pulmones infectados se relacionaron con la mejora de los componentes y la función de las células, como los componentes de la membrana y la vesícula, la respuesta al estrés, la regulación de los procesos apoptóticos, la regulación de la replicación del genoma viral, la activación de los leucocitos y la unión de carbohidratos y otros compuestos orgánicos. Solo S. hispidus había enriquecido GO en tejidos sanos, y estos incluían el componente celular involucrado en el complejo del factor de intercambio guanil-nucleótido.

Cambios categóricos en la expresión génica después de la infección por RSV en (A) S. fulviventer y (B) S. hispidus usando anotaciones Gene Ontology (GO) y GoSeq. Términos GO de SwissProt en el eje y (color coordinado en función del proceso biológico [azul], componente celular [verde] o función molecular [rojo]) con expresión relativa de GO en el eje x (expresado como GeneRatio, que es el proporción de genes expresados ​​diferencialmente en cada categoría de GO con respecto al número total de genes expresados ​​diferencialmente en todos los GO significativos). GeneRatio positivo = enriquecido en pulmones infectados con RSV; GeneRatio negativo = enriquecido en pulmones sanos (sin GO significativos en S. fulviventer sano). Todos los GO fueron estadísticamente significativos (p < 0,05, q < 0,05).

Para confirmar los DEG, se seleccionaron tres genes ensamblados de novo en función de su regulación positiva el día 5 después de la infección (Shisp_DN132151_c0_g1 [IIGP1], Shisp_DN12103_c7_g1 [I27L2], Sfulv_DN158_c1_g1 [IIGP1]). qRT-PCR con SYBR green se realizó con cebadores diseñados para apuntar a cada gen, normalizados al gen de mantenimiento de la β-actina. Los tres genes incluían IIGP1 tanto en S. fulviventer como en S. hispidus e I27L2 en S. hispidus. qRT-PCR confirmó la regulación positiva del gen después de la infección por RSV (es decir, cambios de pliegue positivos) que se correlacionaron con los datos de RNA-Seq (Tabla complementaria 2).

Además, para confirmar y validar aún más el análisis de expresión diferencial publicado por Rajagopala et al.27, donde S. hispidus se infectó con RSV A/Long en la misma instalación con la misma cepa y concentración de virus, comparamos con DEG identificados en este estudio aunque las muestras se recogieron en días diferentes. El estudio de Rajagopala et al.27 incluyó dos puntos temporales; Los días 4 y 6 posteriores a la infección, mientras que en este estudio hemos recolectado muestras solo el día 5. Sin embargo, los parámetros de análisis de DESeq2 utilizados en ambos estudios son los mismos. En comparación con Rajagopala et al.27, este estudio actual confirmó 4 de los 5 DEG eucariotas (IFIT1, MX2, OASL2, RSAD2) que se modificaron el día 4. De manera similar, este estudio confirmó 29 de los 81 DEG después de la infección por RSV ( incluidos CFAB, GBP2/4/5/6, IFIT1, IIGP1, K2C6A, MX2, OASL2, RSAD2; datos completos en el archivo complementario 5) que se modificaron el día 6.

Las ratas algodoneras son excelentes modelos animales preclínicos para el estudio de infecciones por RSV y otros virus, pero sin un genoma publicado para ninguna especie, el análisis genético o transcriptómico en ratas algodoneras es limitado. En este estudio, generamos transcriptomas integrales de múltiples órganos de dos especies endogámicas de ratas algodoneras: S. fulviventer y S. hispidus. La comparación de nuestras dos referencias transcriptómicas reveló grandes diferencias en la homología de la secuencia de transcripción y los niveles de expresión génica de referencia entre cada especie, aunque el número total de genes anotados y categorías funcionales (ontología génica, términos KEGG) fue similar (Tabla 1).

Nuestro ensamblaje y anotación de transcriptomas superan los estándares de calidad e integridad de las referencias de transcriptomas publicadas anteriormente en otros animales35,36,47. La calidad y la profundidad de nuestro ensamblaje del transcriptoma también mejoraron con respecto a nuestro transcriptoma pulmonar anterior de tejidos pulmonares de S. hispidus27 debido a la inclusión de múltiples tejidos. Esto resultó en casi 3 veces el número de transcripciones anotadas (117.153 frente a 38.736) y 6169 anotaciones de genes únicos adicionales en S. hispidus. Además, nuestra aplicación de la referencia del transcriptoma para inferir alteraciones de la expresión génica inducidas por RSV muestra la utilidad de nuestra referencia en el estudio y tratamiento de muchas infecciones, incluido RSV, influenza y otros virus respiratorios.

Nuestro análisis confirmó muchos genes previamente implicados en la infección y la inmunidad del RSV. RSAD2 (o Viperin) es un gen significativamente regulado al alza tras la infección por RSV en S. hispidus que inhibe la formación de filamentos de RSV y la transmisión viral de célula a célula sin inhibir la expresión de proteínas virales48. La viperina también es el gen más regulado en el epitelio nasal humano después del desafío intranasal con Rhinovirus49. Otro gen relacionado con RSV es I27L2, el gen con mayor regulación positiva en S. hispidus y S. fulviventer que también es el gen con mayor expresión diferencial en bebés prematuros con infección grave por RSV50. Otros genes regulados positivamente que también están involucrados en la infección por RSV incluyen las quimiocinas CXCL1051, CXCL1152, LY6E53, MX254, OAS1A55, ISG1556, IRF957, NLRC558 y K2C6A59. También identificamos genes implicados en el sistema del complemento (CFAB, CO4A, C4BPA) y el metabolismo de las prostaglandinas (PGDH), ambos implicados en la respuesta del huésped al RSV60,61. Los resultados de nuestro estudio respaldan la importancia de estos genes en la protección mediada por el huésped contra el RSV y el valor de traducción de la rata algodonera en la investigación viral.

CRY2 (regulado a la baja en S. fulviventer) también se ha atribuido indirectamente a la gravedad de la enfermedad por RSV. CRY2 es un factor de transcripción que modula los ritmos circadianos a través de la supresión de BMAL1, un supuesto regulador de factores celulares esenciales para la replicación viral62. El análisis de las células primarias BMAL1-/- reveló que la baja expresión de BMAL1 aumenta la susceptibilidad a influenza63, virus parainfluenza 3 y RSV64. BMAL1 también muestra una variación estacional en humanos con niveles más bajos en los meses de invierno durante la temporada alta de virus respiratorios62. Si bien este gen necesitará más investigación sobre su papel en la patogénesis del RSV, esta es la primera asociación de expresión modulada durante la infección por RSV.

La rata algodonera imita las infecciones respiratorias en humanos debido a la presencia de genes homólogos humanos que están ausentes en otros roedores de laboratorio (por ejemplo, Mus musculus), es decir, genes MX estimulados por interferón65. Nuestro análisis es consistente con la regulación al alza de MX2 tanto en S. fulviventer como en S. hispidus (así como MX1, MX1B y MX3 en S. fulviventer) tras la infección por RSV como se describió anteriormente66, lo que destaca la importancia de este modelo en la captura de interferón. respuesta inmunitaria inducida al RSV y otros virus. Además, nuestro análisis captura la regulación positiva de IIGP1 en S. fulviventer y S. hispidus. IIGP1 es otro gen humano estimulado por interferón con una importancia y función similares a los genes Mx, pero solo está presente en ratones como un parálogo IGPT67 menos efectivo. Un estudio en ratones con deficiencia de IGPT no encontró una mayor susceptibilidad o producción de citoquinas inducida por interferón hacia patógenos intracelulares como Listeria y citomegalovirus, lo que sugiere un mecanismo anterior diferente en ratones68. Nosotros, por primera vez, anotamos con éxito IIGP1 en ratas de algodón y mostramos su modulación durante la infección por RSV. Si bien se necesitan estudios de validación funcional, los resultados de nuestro estudio argumentan aún más la utilidad de traducción de la rata de algodón como modelo para RSV y otros virus respiratorios en comparación con ratones, que tienen deficiencia de IIGP-1.

CREB1 (cAMP-responsive element-binding protein 1) es un factor transcripcional ampliamente estudiado que modula muchos genes inmunitarios y se reguló a la baja en S. fulviventer tras la infección por RSV. CREB1 promueve respuestas antiinflamatorias como la inhibición de la actividad de NF-κB, la inducción de IL-10 y la generación de Tregs69. Se observó que la activación de CREB1 es un impulsor de la eficacia de la vacuna en vacunas contra el VIH-1 en primates no humanos mediante el reclutamiento de células T CD4+ y células B en el sitio de presentación del antígeno70. Se necesitan futuros estudios funcionales para comprender mejor si existe una asociación entre RSV y CREB1.

Un gen regulado al alza más interesante tanto en S. fulviventer como en S. hispidus, SYWC es un activador inducido por interferón de las vías ERK, Akt y eNOS y la reorganización del citoesqueleto en respuesta al estrés y es un marcador sérico para la tuberculosis pulmonar71. Si bien este estudio es la primera asociación de SYWC con la infección por RSV, un estudio adicional puede descubrirlo como un marcador de infección grave por RSV en tejido y suero.

Si bien hemos presentado una descripción general completa del transcriptoma de rata de algodón, reconocemos algunas limitaciones en nuestro estudio. Datos publicados previamente de Pletneva et al. ha demostrado que diferentes cepas y aislados de RSV tienen una inducción diferencial de genes activados por interferón en ratas de algodón66. Mientras que el estudio de Pletneva et al. solo incluye S. hispidus, esperamos que esto también sea cierto para S. fulviventer debido a una susceptibilidad similar a RSV A/Long. Con este fin, reconocemos que nuestras conclusiones se limitan a RSV A/Long, y se debe considerar la comparación transcriptómica de las variantes de RSV para estudios futuros. Además, identificamos múltiples genes que no se habían implicado previamente en la infección por RSV, como (LG3BP, SYWC, ABEC1, IIGP1, CREB1). Si bien nuestro análisis sugiere posibles mecanismos desconocidos de patogénesis, reconocemos que la asociación de estos genes con la infección por RSV está severamente limitada en ausencia de datos experimentales. Dichos esfuerzos están más allá del alcance de este documento sobre el transcriptoma de rata de algodón de referencia, pero se considerarán para futuros estudios.

Este informe destaca la utilidad del transcriptoma de rata de algodón para comprender los cambios transcriptómicos inducidos por la infección en ausencia de referencias genómicas disponibles. Las referencias del transcriptoma de S. hispidus y S. fulviventer se han puesto a disposición del público en BioProject PRJNA816878 para investigación adicional. Además, la identificación de secuencias de genes permite una mejor comprensión de la genética de las ratas algodoneras y la generación de herramientas moleculares, como cebadores y sondas qRT-PCR dirigidas a genes de interés, proteínas recombinantes, anticuerpos y otros ensayos. El análisis de la expresión génica diferencial reveló diferencias específicas de la especie huésped tras la infección por RSV. Dado que el desarrollo de la terapia contra el VSR exige modelos preclínicos sólidos y bien desarrollados para el VRS, esperamos que nuestras referencias transcriptómicas y las asociaciones de genes con el VRS puedan acelerar las intervenciones biomédicas contra este patógeno de gran importancia para la salud pública.

Se obtuvieron ratas algodoneras S. hispidus (n = 8 machos, 1 hembra) y S. fulviventer (n = 8 machos, 1 hembra) de cuatro a seis semanas de edad (~ 100 g) de la colonia endogámica mantenida en Sigmovir Biosystems , Inc. Las ratas algodoneras de la colonia fueron seronegativas por ELISA a virus respiratorios adventicios (es decir, virus de la neumonía de ratones, parvovirus de rata, coronavirus de rata, virus Sendai). Cada especie se dividió aleatoriamente en 2 grupos: controles infectados con RSV (n = 5) y no infectados (n = 4). El ensamblaje y la anotación del transcriptoma se realizaron en todos los tejidos (pulmón completo, intestino grueso, corazón, bazo y riñón) de 2 machos dentro de cada grupo no infectado. Las hembras solo se incluyeron en los grupos infectados por RSV. Para evitar peleas, todos los animales fueron alojados individualmente en grandes jaulas de policarbonato y alimentados con una dieta de comida estándar para roedores y agua ad libitum. Todos los procedimientos con animales siguieron las pautas de NIH y USDA aprobadas por Sigmovir Biosystems, Inc. IACUC. El diseño del estudio, el análisis y el informe de métodos y resultados se presentan de acuerdo con las pautas ARRIVE.

La cepa Long de RSV A/Long (ATCC Cat. # VR-26) se propagó en células HEp-2, y el título viral se determinó usando un ensayo de placas. Se inocularon ratas algodoneras por vía intranasal bajo anestesia con isoflurano con 105 unidades formadoras de placas en 100 µl de suspensión RSV o vehículo PBS. Los animales se sacrificaron por inhalación de dióxido de carbono el día 5 de la infección. Se diseccionaron pulmones completos, intestino grueso, corazón, bazo y riñón de todos los animales y se congelaron en RNA-later (Invitrogen AM7021) para su procesamiento y secuenciación en VUMC.

Los pulmones (lóbulo derecho) se diseccionaron y se inflaron con formalina tamponada neutra al 10% y se sumergieron en formalina para su fijación. Los pulmones se incluyeron en bloques de parafina, se seccionaron y se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E). Los patólogos desconocían el grupo de estudio y se examinaron los portaobjetos en busca de 4 parámetros de infiltración e inflamación de células inmunitarias pulmonares, como se describió anteriormente72: peribronquiolitis (bronquiolos), perivasculitis (pequeños vasos sanguíneos), neumonía intersticial (paredes alveolares) y alveolitis (espacio alveolar). ) (enumerados de menor a mayor gravedad). A cada condición se le asignó una puntuación de 0 a 4, donde 0 es sin patología y 4 es máxima patología. Las puntuaciones corresponden al porcentaje de patología presente en el campo de visión representado en la Fig. 4A (0 = 0 %, 1 = 5 %, 2 = 25 %, 3 = 75 % y 4 = 100 %). Las puntuaciones de patología acumuladas se calcularon sumando la puntuación mediana para cada condición.

El número de copias de ARN viral se determinó utilizando la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) a partir de ARN extraído de homogeneizados de pulmón (lóbulo lingular) (consulte la siguiente sección Extracción de ARN y preparación de bibliotecas de ADNc para conocer los métodos de extracción). Después de la extracción, se generó cDNA utilizando 1 ug de RNA total y el kit SuperScript™ III Reverse Transcriptase (Invitrogen™) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El cDNA se diluyó 1:5 y se agregaron 3 ul a las reacciones de qPCR usando iQ™ SYBR® Green Supermix (10 ul en total). Las reacciones para cada objetivo se realizaron por duplicado para cada muestra usando cebadores (IDT, concentración final de 250 nm) dirigidos al ARNm de G y F del RSV y β-actina, que se publicaron y validaron previamente para su uso en ambas especies de ratas algodoneras73. En cada placa se corrieron controles sin plantilla y un control positivo (ARN extraído de la reserva viral RSV A/Long utilizada para la infección). Los valores de CT para G y F se promediaron y normalizaron a β-actina. Los resultados se calcularon utilizando el método 2−ΔΔCT74. Las cifras y el análisis estadístico se realizaron utilizando la prueba de comparaciones múltiples de ANOVA/Tukey en Prism 8.

El ARN se preparó como se describió previamente27. En resumen, se homogeneizaron pequeñas secciones de pulmón de rata algodonera (lóbulo lingular), intestino grueso (colon de ~ 20 mm, lavado con PBS estéril), bazo, riñón y corazón utilizando un NextAdvance Bullet Blender® con tubos RED RINO™ que contenían 3,2 mm microesferas de acero inoxidable (SSB32) y 2 × volumen de QIAzol® Lysis Regent (Qiagen, n.° de cat. 79306) a velocidad máxima durante 3 min. El ARN se extrajo de los homogeneizados usando el kit RNeasy® Plus Universal Mini (Qiagen, cat. No. 73404) a través de QIAzol® adicional (volumen total 900 ul), eliminador de gDNA y cloroformo con columna de digestión con DNasa según lo recomendado por el protocolo del fabricante. La calidad del ARN se midió con un bioanalizador Agilent 2100 (Agilent Technologies, CA, EE. UU.). El ARNr del huésped se eliminó con el kit de agotamiento de ARNr NEBNext v2 (n.º de catálogo: NEB E7400X). Las bibliotecas de ADNc se prepararon con 1 μg de ARN total de cada muestra con el kit de preparación de bibliotecas de ARN NEBNext Ultra II para Illumina (n.º de cat.: NEB E7805L) siguiendo el protocolo del fabricante para ARN intacto (RIN > 7), perlas AMPure XP para los pasos de limpieza (Beckman, n.º de cat. A63881) y NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Juego 1, n.º de cat.: E7600S) para agrupar muestras. La secuenciación se realizó utilizando la secuenciación Illumina NovaSeq6000 2 × 150 pb en las instalaciones centrales de Vanderbilt Technologies for Applied Genomics (VANTAGE).

Luego, los datos se analizaron en muestras individuales por código de barras. Las secuencias del adaptador, la baja calidad (mínimo Phred 33) y las lecturas cortas (< 75 pb) se eliminaron con Trimmomatic (versión 0.36, "ILLUMINACLIP: NEB_multiplexoligos.fa:2:30:10 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:75 ")75. Solo se conservaron las lecturas emparejadas que superaron el umbral de calidad descrito en 76.

Se utilizaron alrededor de 921 millones de lecturas de extremos emparejados de tejidos sanos para el ensamblaje del transcriptoma de novo utilizando el paquete de software Trinity v2.13.131, con parámetros predeterminados de cobertura de 50 ×. Para el análisis experimental se utilizaron 314,5 millones de lecturas emparejadas adicionales de pulmones infectados con virus. Se ensamblaron contigs para S. fulviventer y S. hispidus agrupando primero contigs/transcritos individuales en "genes", seguido de la construcción de gráficos de Bruijn para informar isoformas empalmadas alternativamente de longitud completa. Luego, todas las transcripciones se filtraron mediante un corte de longitud de transcripción de < 200 pb usando SeqKit32, anotación de contaminantes (anotación Blast de "virus", "bacterias" u "hongos"), similitud de secuencia del 95 % o más usando CD-HIT33 y eliminación de ARNm redundantes seleccionados por la canalización EvidentialGene tr2aacds34. Las estadísticas de ensamblaje de las transcripciones finales, como el número medio de transcripciones, la longitud de la transcripción, la longitud media de la transcripción, N50, se enumeran en la Tabla 1. Las lecturas sin procesar y los datos de ensamblaje se depositarán en SRA bajo BioProject PRJNA816878 una vez que se acepte el manuscrito para su publicación.

El paquete RSEM se utilizó para cuantificar y normalizar la abundancia de genes e isoformas a partir de datos de RNA-Seq de extremos emparejados77. RSEM permite una cuantificación precisa de la transcripción por muestra y tipo de muestra sin un genoma de referencia. El TPM (transcripción por millón de lecturas mapeadas) se calculó utilizando el paquete RSEM con el alineador Bowtie2, y se usó un límite de TPM > 1 para filtrar las transcripciones ensambladas de baja calidad para usar en el análisis de expresión diferencial. El Ex90N50 se calculó utilizando el script Trinity contig_ExN50_statistic.pl.

La tubería de anotación Trinotate v3.2.2 se usó para anotar transcripciones de S. hispidus y S. fulviventer. BlastX y BlastP (valor límite de e-05)42 se usaron para encontrar la homología de secuencia de cóntigos individuales y regiones de codificación de proteínas (determinadas por Transdecoder, https://github.com/TransDecoder/TransDecoder) contra la base de datos UniProt/SwissProt41 (datos encontrados en el archivo complementario 6). Términos KEGG43, términos Gene Ontology44 y términos EggNOG45 de la alineación de la base de datos Swissprot41 con BLAST42. Otras herramientas dentro de la tubería anotaron transcripciones basadas en dominios de proteínas a través de Pfam78, hélices transmembrana a través de TmHMM79 y proteínas de señalización80.

Los pulmones aislados de los grupos infectados y no infectados por RSV se procesaron y secuenciaron como se describe anteriormente. La canalización Trinotate se usó para anotar todas las lecturas de grupos experimentales contra nuestra referencia. Los niveles de expresión normalizados de las transcripciones en los tejidos se determinaron utilizando Salmon81 y la métrica TPM (transcripciones por millón); solo se usaron transcripciones con un TPM> 1 para el análisis de expresión diferencial aguas abajo (S. fulviventer = 270, 451, S. hispidus = 474, 882). Las matrices de conteo sin procesar a nivel de gen para cada especie se pueden encontrar en el archivo complementario 7. El paquete DESeq238 se usó dentro de la tubería para comparar el grupo experimental (pulmones infectados con RSV) que contenía réplicas biológicas con el grupo de control correspondiente (pulmones no infectados). Genes con p < 0,05, p ajustado < 0,05 ("q"/tasa de descubrimiento falso/Benjamini-Hochberg) y un cambio log2 >|1| fueron tratados como expresados ​​diferencialmente. Usamos el paquete goseq en Bioconductor para detectar términos GO diferencialmente abundantes44. Los GO con p < 0,05 y p ajustado < 0,05 ("q"/tasa de descubrimiento falso/Benjamini-Hochberg) se trataron como expresados ​​diferencialmente.

El ARN extraído del tejido pulmonar se utilizó para los ensayos de qRT-PCR. La qRT-PCR se realizó por duplicado con el kit SuperScript™ III Reverse Transcriptase (Invitrogen™) y iQ™ SYBR® Green Supermix como se describió anteriormente. Los cebadores qRT-PCR se diseñaron para 3 genes regulados al alza seleccionados al azar en función del ensamblaje de novo y el análisis de expresión diferencial (Shisp_DN132151_c0_g1, Shisp_DN12103_c7_g1, Sfulv_DN158_c1_g1). Los cebadores se diseñaron utilizando Primer3Plus82 y se informan en la Tabla complementaria 2. Se ejecutaron controles sin plantilla en cada placa. Los valores de CT replicados técnicos se promediaron para cada gen y se normalizaron al gen de mantenimiento de la β-actina. Los resultados se calcularon como la inducción del cambio de veces en los pulmones no infectados utilizando el método 2−ΔΔCT74. Además, para confirmar aún más la expresión diferencial de los genes, comparamos los resultados de nuestro estudio actual con nuestra anotación anterior del transcriptoma pulmonar de S. hispidus tras la infección por RSV27 utilizando los mismos parámetros de significación de DESeq2 (p < 0,05, q < 0,05, l2fc >| 1.0|).

Ningún sujeto humano participó en este estudio. Todos los procedimientos con animales siguieron las pautas de NIH y USDA y fueron aprobados por Sigmovir Biosystems, Inc. IACUC.

Los datos de secuenciación se depositarán en el archivo de lectura corta (SRA) de NCBI tras la aceptación del manuscrito bajo BioProject PRJNA816878. Para otros detalles, comuníquese con los autores correspondientes para solicitudes de datos específicos.

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Agradecemos al Sr. Charles Smith y la Sra. Martha Malache, técnicos de ABSL2 en Sigmovir Biosystems Inc., por la crianza, el manejo y el cuidado de las ratas de algodón. Agradecemos a Angela Jones y otros en VANTAGE por el control de calidad y la secuenciación de nuestras muestras.

Este trabajo fue apoyado por fondos del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas (con los números de adjudicación R21AI142321-02S1, R21AI142321, R21AI154016 y R21AI149262); Este trabajo fue apoyado por subvenciones AI163543, AI109926, AI125215 a JCGB; los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC) 75D3012110094; el Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre (con los números de concesión K23HL148638 y R01HL146401) y Vanderbilt Technologies for Advanced Genomics Core (apoyo de los Institutos Nacionales de Salud con los números de concesión UL1RR024975, P30CA68485, P30EY08126 y G20RR030956). Los contenidos son responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente los puntos de vista oficiales de las agencias de financiación.

Departamento de Patología, Microbiología e Inmunología, Centro Médico de la Universidad de Vanderbilt, Nashville, TN, EE. UU.

Britton A. Strickland y Suman R. Das

División de Enfermedades Infecciosas, Departamento de Medicina, Centro Médico de la Universidad de Vanderbilt, 1211 21st Avenue South, S2108 Medical Center North, Nashville, TN, 37232, EE. UU.

Seesandra V. Rajagopala, Meghan H. Shilts, Suman B. Pakala y Suman R. Das

Sigmovir Biosystems Inc., 9610 Medical Center Drive, Suite 100, Rockville, MD, 20850, EE. UU.

Arash Kamali, Marina S. Boukhvalova y Jorge CG Blanco

Departamento de Ciencias de la Computación, Grupo de Genómica y Bioinformática, Universidad de Florida Central, Orlando, FL, EE. UU.

Yosef Shibu

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BAS, SVR, SY, JCGB y SRD contribuyeron al diseño del estudio. AK y MSB contribuyeron a los experimentos con animales y la recolección de muestras. BAS contribuido al procesamiento de muestras y secuenciación. BAS contribuyó a los análisis bioinformáticos y estadísticos con la consulta de SVR, MHS, SBP y SYJCGB y SRD obtuvo los fondos de investigación que respaldan este estudio. BAS y SRD escribieron la versión inicial del manuscrito y todos los autores revisaron y aprobaron la versión final. Todos los autores han revisado el manuscrito y dan su consentimiento para su publicación.

Correspondencia a George CG White o Suman R. Das.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Strickland, BA, Rajagopala, SV, Kamali, A. et al. Cambios transcriptómicos específicos de la especie tras la infección por el virus respiratorio sincitial en ratas algodoneras. Informe científico 12, 16579 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-19810-4

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Recibido: 27 mayo 2022

Aceptado: 05 septiembre 2022

Publicado: 04 octubre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-19810-4

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